Transforming growth factor-beta (TGF-ß) is a multifunctional growth factor involved in a variety of cellular processes including wound healing, extracellular matrix deposition, inflammation, and fibrosis. Excessive TGF-ß signaling during wound healing causes sustained inflammation and elevated expression of extracellular matrix proteins, which have both been associated with fibrosis and scarring. Therefore, inhibition of TGF-ß during wound healing is an attractive target to reduce fibrotic skin disorders. Our lab is interested in CD109, a 150 kDa GPI-anchored protein which has been shown to bind TGF-ß in its soluble form and to inhibit TGF-ß signaling in keratinocytes and fibroblasts in vitro. The TGF-ß antagonist properties of CD109 suggest that modulation of its expression in vivo might ameliorate fibrosis and scarring, perhaps via differential activation of keratinocytes and fibroblasts. To investigate the role of CD109 in the skin, we generated transgenic mice overexpressing CD109 in the epidermis.To explore the role of CD109 during wound healing, I conducted incisional and excisional wound healing studies using CD109 transgenic mice and wild-type littermate controls. These studies demonstrate improved scarring parameters including reduced myofibroblast differentiation, reduced granulation tissue, and improved extracellular matrix architecture in the CD109 transgenic mice. Additionally, the data in this thesis show that overexpression of CD109 in the epidermis inhibits immune cell recruitment, and is associated with a reduction in expression of the proinflammatory cytokines IL-1 and MCP-1. I correlated these data with immunohistochemical analysis of Smad2/3 phosphorylation, and show that CD109 overexpression is associated with a reduction in TGF-ß signaling. Collectively, these data suggest that overexpression of CD109 in the epidermis inhibits fibrosis during wound healing in a TGF-ß dependent manner.To better understand the role of CD109 in fibrosis, I employed a murine bleomycin-induced model of fibrosis, which exhibits similarities to scleroderma, in CD109 transgenic mice and wild-type littermates. This study shows that CD109 transgenic mice express reduced levels of the extracellular matrix proteins fibronectin and collagen I, as well as Smad2/3 phosphorylation, and also display improved extracellular matrix architecture and reduced dermal thickness. Collectively, these data suggest that CD109 resists bleomycin-induced fibrosis, and could thus be an attractive target for therapeutic treatment of fibrotic skin disorders.To better understand how CD109 modulates TGF-ß in vivo, I analyzed the TGF-ß signaling molecules in skin, primary keratinocytes, and primary fibroblasts harvested from CD109 transgenic mice and wild-type littermates. Here, I show that CD109 transgenic mice express less collagen I and fibronectin, and display elevated ALK1 expression and signaling through the Smad1/5/8 pathway while wild-type mice express elevated ALK5 and preferentially signal through the Smad2/3 pathway. Investigation of cultured keratinocytes showed a similar expression pattern, with the only difference existing in the expression of ALK1 and ALK5 which were both increased in the CD109 transgenic keratinocytes, and fibroblasts from both genotypes showed similar expression patterns. In both cultured keratinocytes and whole skin extracts, the CD109 transgenic tissue expressed less TGF-ß than their wild-type counterparts. The differential TGF-ß signaling described here could underscore our previous observations indicating that overexpression of CD109 inhibits scarring and fibrosis in vivo.Collectively, the data presented here demonstrate that CD109 potently alters physiological processes in the skin in vivo. The capacity for CD109 to reduce scarring, fibrosis, and inflammation in vivo makes it an attractive target for treating fibrotic skin disorders. / Le facteur de croissance transformant bêta (TGF-ß), est un facteur de croissance multifonctionnel impliqué dans une multitude de processus cellulaires tel que la cicatrisation, la déposition de matrice extracellulaire, l'inflammation et la fibrose. Ainsi, l'inhibition de TGF-ß semble être une cible de choix pour réduire les désordres fibrotiques de la peau. Notre laboratoire a identifié CD109, une proteine de 180 kDa ancrée à un glycosylphosphatidylinositol agissant comme co-récepteur cellulaire de TGF-ß. Ce nouveau récepteur, auquel TGF- ß s'ancre avec très haute affinité, aurait pour propriété d'inhiber la signalisation intra-cellulaire de TGF-ß. Les propriétés antagonistes de CD109 suggèrent que la modulation de son expression in vivo dans la peau pourrait améliorer la cicatrisation et la fibrose cutanée. Pour investiguer le role de CD109 dans la peau, nous avons généré une souris transgénique en clonant CD109 en aval du promoteur de keratin-14, limitant ainsi la surexpression de CD109 à l'épiderme.Afin d'explorer le rôle de CD109 au sein de la guérison des plaies, nous avons conduit des études de ce processus où nous avons pu observer une amélioration des paramètres de cicatrisation tels que la réduction de la différentiation des myofibroblastes, la réduction du tissu de granulation et une amélioration de l'architecture de la matrice extracellulaire chez les souris transgénique CD109 comparées au souris de génotype sauvage pour la même portée. De plus, la surexpression de CD109 dans l'épiderme inhibe le recrutement de cellules immunitaires au site de la plaie et est associé avec une réduction de la signalisation de TGF-ß ainsi que l'expression des cytokines pro-inflammatoire IL-1 et MCP-1. Toutes ces données, suggèrent que la surexpression de CD109 dans l'épiderme inhibe la fibrose cutanée lors de la guérison des plaies.Nous avons ensuite examiné le rôle de CD109 lors de la fibrose en utilisant un model de sclérodermie murine induit par bleomycine. La souris transgénique CD109 exprime des niveaux réduits des protéines fibronectine et collagène 1 dans la matrice extracellulaire, ainsi que des niveaux réduits de phosphorylation de Smad2/3. Elle démontre aussi une meilleure architecture de la matrice extracellulaire et une réduction de l'épaisseur de la couche dermique. Toutes ces données suggèrent que CD109 résiste à la fibrose induite par bleomycine. Cela pourrait donc en faire une cible attrayante pour traitement thérapeutique des désordres fibrotiques de la peau.Pour mieux comprendre comment CD109 modifie l'action de TGF-ß in vivo, nous avons analysé les molécules de signalisation de TGF-ß dans la peau, les keratinocytes primaires et les fibroblastes primaires récoltés des souris transgéniques et de leur sœurs de portée du génotype sauvage. Les souris transgéniques CD109 expriment substantiellement moins de collagène I, de fibronectine et démontre une expression élevée de ALK1 et une activation élevée de la voie Smad1/5/8. Les études utilisant des keratinocytes cultivés démontrent une phosphorylation de Smad et une expression des gènes de la matrice extracellulaire similaire; l'expression de ALK1 et ALK5 étant toutefois plus élevée dans les keratinocytes transgéniques CD109 comparé à ceux du génotype sauvage. Les fibroblastes des deux génotypes démontrent des profils d'expression similaires. La signalisation différentielle de TGF-ß pourrait rehausser nos observations précédente et ainsi renforcer l'idée que la surexpression de CD109 inhibe la cicatrisation et la fibrose cutanée in vivo.Ainsi, les données présentée démontrent que CD109 est un puissant altérateur des processus physiologiques de guérison des plaies, cicatrisation, fibrose et inflammation dans la peau in vivo. La capacité pour CD109 de réduire la cicatrisation, la fibrose et l'inflammation dans la peau in vivo en font une cible attrayante pour traiter les désordres fibrotiques de la peau.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.116840 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Vorstenbosch, Joshua |
| Contributors | Anie Philip (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Surgery) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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