The Src kinases are non-receptor tyrosine kinases involved in many epithelial processes in both normal and injured cells. Src was originally identified as a viral oncogene and has since been characterized as an important regulator of cellular proliferation, differentiation, and motility. Our lab has previously demonstrated that the Src kinases are important modifiers of gene expression in tubule cells of the kidney during ischemia-reperfusion injury. The signalling events that control and mediate the Src kinase transcriptional response in renal epithelial cells are not well understood. In this thesis, I have identified two novel negative regulators of the Src transcriptional response in renal epithelial cells. In Manuscript I and II, I demonstrate that the adapter protein Dok-4 can act as an inhibitor of Src-mediated transcription. Unlike most other adapter proteins, several members of the Dok family are primarily characterized by their inhibitory actions downstream of active tyrosine kinases. Despite being the most ubiquitously expressed Dok family member, Dok-4 function has remained elusive as few interacting proteins have been identified. In Manuscript I, we found that the previously defined boundaries of the Dok-4 PTB domain needed to be extended for proper function. We demonstrate that the PTB domain of Dok-4 contains an extended C-terminal alpha helix critical for canonical PTB-mediated interaction and identified the lipid phosphatase Ship1 as a novel partner of this redefined Dok-4 PTB domain. This interaction is greatly increased in the presence of active Src kinases and occurs through a canonical NPXpY motif present in the C-terminal region of Ship1. In contrast to the Dok-4-Ship1 interaction, in Manuscript II we present a non-canonical PTB-mediated interaction between Dok-4 and the nuclear transcription factor, Elk4. This interaction leads to relocalization of Elk4 from the nucleus to the cytoplasm and degradation of full-length Elk4. In renal cells, Dok-4 inhibits Src-mediated activation of Elk4 and represses expression of the immediate early genes, such as egr-1 and fos1, as well as some of their transcriptional targets. In agreement with this data, knock-down of Dok-4 was associated with increased proliferation of renal epithelial cells. During renal ischemia-reperfusion injury, where upregulation of immediate early genes is known to occur, we have for the first time detected a strong activation of the Src kinases and a delayed upregulation of Elk4, suggesting that Elk4 may be not only highly expressed, but also highly active. Dok-4, which is expressed in the kidney, may be essential for limiting damage to the kidney caused by Elk4-induced expression of the immediate early genes. In addition to activating transcription of the immediate early genes, we have previously shown that the Src kinases are responsible for transcriptionally upregulating the receptor tyrosine kinase, EphA2, during renal ischemia-reperfusion injury. In the preliminary manuscript presented here, we observed that while the Src kinases are highly active, the Stat proteins, downstream effectors of the Jak kinases, are dephosphorylated and inactive. As a corollary of this observation, overexpression of all three ubiquitous Jak family members, Jak1, Jak2 and Tyk2 could attenuate Src-mediated activation of the EphA2 promoter. Inhibition of endogenous Jak kinase by siRNA-mediated knock-down or incubation with the pharmacological inhibitor, Jak inhibitor I also activated EphA2 transcription. Surprisingly, Jak-mediated inhibition of EphA2 expression occurs independently of the Stat family and the cytokine receptors. Collectively, this thesis identifies two novel regulators of the Src kinase family in renal epithelial cells, the Dok-4 adapter protein and the family of Jak kinases. / Les kinases Src sont des tyrosine-kinases cytosoliques qui sont impliquées dans multiples processus dans les cellules épithéliales et autres. Originalement identifiée comme un oncogène viral, la kinase Src est maintenant caractérisée comme une régulatrice de la prolifération, la différenciation et la motilité cellulaire. Nous avons précédemment montré que les kinases Src sont capables de modifier l'expression génique dans les tubules des reins durant le domage rénal par ischémie et réperfusion. Cependant, les mécanismes de signalisation qui contrôle la réponse transcriptionelle des kinases Src ne sont pas bien compris. La présente thèse décrit deux nouveaux inhibiteurs endogènes de la famille de kinases Src dans les cellules rénale épithéliales.Les deux premiers manuscrits établissent que la protéine adaptatrice Dok-4 fonctionne comme un inhibiteur des kinases Src. Contrairement à la plus part de protéines adaptatrices, la famille Dok est caractérisée par des actions inhibitrices durant la signalisation par les tyrosines kinases. Malgré que Dok-4 soit le membre de la famille Dok exprimé de manière la plus ubiquitaire, sa fonction est encore mal connue. Le premier manuscrit que je présente (Manuscrit I) décrit le domaine PTB de Dok-4. On y a démontré que le domaine PTB contient une extension C-terminal consistant probablement en une hélice alpha et que celle-ci est essentielle pour les interactions canoniques du domaine PTB de Dok-4. De plus, nous avons identifié la phosphatase lipidique Ship1 comme un nouveau partenaire de ce domaine PTB redéfini. Cette interaction est augmentée quand les kinases Src sont actives et elle implique un motif NPXpY dans la région C-terminale de Ship1. Contrairement à l'interaction entre Dok-4 et Ship1, l'interaction décrite dans le deuxième manuscrit (Manuscrit II) entre Dok-4 et le facteur de transcription, Elk4, implique le domaine PTB, mais se fait dans une manière atypique. L'interaction entre Dok-4 et Elk4 induit la relocalisation d'Elk4 du noyau au cytoplasme et cause la dégradation de la protéine Elk4. Dans les cellules rénales, Dok-4 inhibe l'activation d'Elk4 par les kinases Src et réprime l'expression des gènes de réponse précoce ("immediate early genes"), comme egr-1 et fos, et quelques cibles transcriptionelles de ces gènes. En accord avec ces données, suppression de Dok-4 est associée avec une augmentation de prolifération. En utilisant un modèle in vivo d'ischémie-reperfusion rénale, où la surexpression de gène de réponse précoce a déjà été démontrée, nous avons détecté une forte activation des kinases Src suivie d'une augmentation retardée de l'expression d'Elk4 dans les lysates de reins. Ces données suggèrent que dans ce modèle Dok-4 pourrait être critique pour limiter les dommages aux reins causé par l'induction des gènes de réponse précoce par Elk4. En plus d'activer l'expression des gènes de réponse précoce, nous avons précédemment montré que les kinases Src sont impliquées dans l'induction transcriptionnelle du récepteur tyrosine-kinase, EphA2, durant l'ischémie-reperfusion rénale. Dans le manuscrit préliminaire que je présente, nous avons noté que dans un modèle de déplétion et réplétion d'ATP, les kinases Src sont activées et les protéines Stat, des effecteurs des kinases Jak, sont déphsophorylés et inactives. Comme corollaire de cette observation, la surexpression de trois membres de de la famille Jak inhibent l'activation du promoteur d'EphA2 par les Src kinases. En plus, l'inhibition des kinases Jak endogènes par traitement aux siRNA ou par un inhibiteur pharmacologique, Jak Inhibitor I, active le promoteur d'EphA2. Étonnement, l'inhibition de l'expression d'EphA2 par les kinases Jak se fait indépendamment des protéines Stat et les récepteurs à cytokines. Mises ensemble, les données de cette thèse démontrent deux nouveaux inhibiteurs de la famille Src dans les cellules rénales épithéliales, la protéine adaptatrice, Dok-4 et les kinases, Jak1 et Jak2.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.116932 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Hooker, Erika |
| Contributors | Serge Lemay (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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