Introduction: Uveal melanoma (UM) is an intraocular tumor that affects 4-6 people per million in the United States, 40% of which will develop liver metastasis within five years. Vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) has been extensively studied in cancer due to the requirement for additional vasculature in tumors. Bevacizumab is a humanized monoclonal antibody that binds VEGF-A and is approved for the treatment of various malignancies. Herein, we investigated the expression of VEGF-A in three UM cell lines and the effects of inhibiting VEGF-A on their functional abilities. We also determined if positive VEGF-A expression can predict metastasis in a UM model and in patients. Materials and Methods: VEGF-A secretion was evaluated in three UM cell lines using sandwich ELISA. Proliferation, migration, and invasion assays were performed before and after the administration of bevacizumab and cytokine expression was assessed by ELISA. One cytokine that was upregulated following bevacizumab treatment (CCL3) was knocked down using siRNA, and the functional assays were repeated using CCL3 siRNA and combination treatments. Uveal melanoma tumors (n = 27) from an animal model and tumors from human patients (n = 29) were immunostained for VEGF-A. Two different custom immunostaining quantification algorithms implemented with ImageJ software were used to automatically count positive cells and positive staining area. Binary logistic regression was performed to determine if positive staining could predict metastases. P < 0.05 was considered significant. Results: All three UM cell lines produced and secreted VEGF-A and expressed VEGF-R2. Bevacizumab usurped VEGF-A and reduced phosphorylated-VEGF-R2. Proliferation and migration were reduced following bevacizumab treatment (p < 0.05 for one cell line, and p < 0.05 for two cell lines, respectively). Both CCL3 and MMP-9 were significantly upregulated after bevacizumab treatment in all cell lines (p < 0.05). Proliferation was significantly reduced in all three cell lines following CCL3 siRNA and combination treatments (p < 0.05). Migration was significantly reduced in all three cell lines after combination treatment (p < 0.05) and invasion was significantly reduced in two cell lines following siRNA (p < 0.05). In general, combination therapy was more effective than bevacizumab monotherapy for inhibiting UM functional abilities. In both rabbit and human tissue, VEGF-A positivity could be used to significantly predict metastasis (p > 0.05). Conclusions: Auto and paracrine VEGF-A signalling is abundant in UM cell lines, but inhibiting VEGF-A has only moderate effects on their functional abilities. This is attributable to compensatory effects, including the upregulation of CCL3. In addition, VEGF-A staining correlated with metastatic development in our patient cohort. VEGF-A is a powerful cytokine that may play a role in UM development and progression. However, compensatory effects induced by bevacizumab suggest that dual or multiple therapies may be required to effectively treat this tumor. / Introduction: Le mélanome uvéal (MU) est une tumeur intra-oculaire qui affecte 4 à 6 personnes par million aux États-Unis, dont 40% développeront des métastases du foie dans les cinq ans. Le facteur de croissance vasculaire endothélial A (VEGF-A) a été largement étudié sur le cancer en raison de l'exigence de la vascularisation des tumeurs supplémentaires. Le bevacizumab est un anticorps monoclonal humanisé qui se lie au VEGF-A et il est approuvé pour le traitement de diverses tumeurs malignes. Ici, nous avons étudié l'expression du VEGF-A dans trois lignées cellulaires du MU et les effets de l'inhibition du VEGF-A sur leurs capacités fonctionnelles. Nous avons également déterminé si VEGF-A positif d'expression ne peut prédire les métastases dans un modèle UM et chez les patients. Matériaux et méthodes: VEGF-A sécrétion a été évaluée dans trois lignées cellulaires du MU en utilisant ELISA en sandwich. Des tests de prolifération, la migration et l'invasion ont été réalisés avant et après l'administration de l'expression des cytokines et bevacizumab a été évaluée par ELISA. Une cytokine qui a été régulée à la hausse après le traitement bevacizumab (CCL3) a été renversée à l'aide de siRNA, et les tests fonctionnels ont été répétés en utilisant CCL3 siRNA et des traitements combinés. Des tumeurs de MU (n = 27) provenant d'un modèle animal et des tumeurs provenant de patients humains énucléés (n = 29) ont été immunocolorées pour le VEGF-A. Deux différents algorithmes de quantification immunomarquage mis en œuvre avec le logiciel ImageJ ont été utilisés pour compter automatiquement des cellules positives pour la région et une coloration positive. La régression logistique binaire a été effectuée pour déterminer si une coloration positive pouvait prédire les métastases. P <0,05 était considérée comme significative. Résultats: Les trois lignées cellulaires de MU ont produites et sécrétées du VEGF-A et ont exprimées du VEGF-R2. Le bevacizumab usurpé VEGF-A et réduit phosphorylée-VEGF-R2. La prolifération et la migration ont été réduites à la suite du traitement par le bevacizumab (p <0,05 pour une lignée cellulaire, et p <0,05 pour les deux lignées cellulaires, respectivement). Les deux CCL3 et MMP-9 étaient significativement augmentés à la hausse après le traitement par le bevacizumab dans toutes les lignées cellulaires (p <0,05). La prolifération a été réduite de façon significative dans les trois lignées cellulaires à la suite CCL3 siRNA et des traitements combinés (p <0,05). La migration a été significativement réduite dans les trois lignées cellulaires après le traitement combiné (p <0,05) et l'invasion a été considérablement réduite dans les deux lignées cellulaires suivantes siRNA (p <0,05). En général, la thérapie combinée était plus efficace que la monothérapie bevacizumab pour inhiber les capacités fonctionnelles du MU.Dans les deux lapins et les tissus humains, la présence du VEGF-A pourrait être utilisée pour prédire de façon significative des métastases (p> 0,05). Conclusions: La signalisation autocrine et paracrine du VEGF-A est abondante dans les lignées cellulaires du MU, mais l'inhibition du VEGF-A n'a que des effets modérés sur ses capacités fonctionnelles. Cette situation est attribuable à des effets compensatoires, y compris la régulation positive du CCL3. En outre, le VEGF-A coloration peuvent être utilisées pour identifier les patients prédisposés au développement métastatique. Le VEGF-A est une cytokine puissante qui peut jouer un rôle dans le développement et la progression du MU. Cependant, les effets compensatoires induits par le bevacizumab suggèrent que les thérapies doubles ou multiples peuvent être nécessaires pour traiter efficacement ce type de tumeur.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.119440 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Logan, Patrick |
| Contributors | Miguel Noel Burnier (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Pathology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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