Arterial restenosis, which occurs in up to 20% of angioplasty patients, is characterized by an excessive vascular smooth muscle cell proliferation resulting from the removal of the endothelial cell lining. Circulating endothelial progenitor cells (EPCs) have the ability to re-colonize and repair the damaged vascular endothelium, reducing restenosis. Nitric oxide (NO) contributes to mobilization and functional activity of EPCs, and estrogen has been shown to increase circulating EPC levels and accelerate the reendothelialization process by EPCs in mice. Moreover NO is important for transducing estrogen-dependent signalling and reendothelialization. We hypothesized that overexpressing endothelial nitric oxide synthase (eNOS), alone or in combination with estrogen treatment, would potentiate the beneficial effects of EPCs in the context of restenosis.We found that native human early outgrowth EPCs (hEPCs) did not have any effect on human coronary artery smooth muscle cell (hCASMC) proliferation and migration In vitro, evaluated by BrdU incorporation and wound scratch assay respectively. In contrast, the NO donor SNAP significantly decreased the proliferation and migration of hCASMCs. Thereafter, hEPCs were either transfected with a human eNOS plasmid or stimulated with 17β-estradiol (E2) prior to being co-cultured with hCASMCs. Total eNOS protein and eNOS phosphorylation levels were increased by 3- to 3.5-fold in eNOS-transfected or E2-stimulated hEPCs, evaluated by western blot. This was associated with a 3-fold increase in NO production, performed by DAF-FM diacetate immunofluorescence (p<0.05). In eNOS-overexpressing hEPCs, enhanced Bcl-2/Bax ratio and reduced Annexin V/propidium iodide labeling indicated increased survival. Interestingly, we observed a significant (p<0.05) decrease in hCASMC migration when co-cultured with eNOS-overexpressing hEPCs, by 23%, or with E2-stimulated hEPCs, by 56%. However, hCASMC proliferation was not affected by either eNOS-overexpressing or E2-stimulated hEPCs. These results suggest that overexpressing eNOS in hEPCs increases their survival and enhances their capacity to modulate hCASMC migration through paracrine effects. / La resténose artérielle, qui se produit dans presque 20% des patients ayant subi une angioplastie, est caractérisée par une prolifération excessive des cellules musculaires lisses vasculaires résultant de la disparition du revêtement des cellules endothéliales. Les progéniteurs endothéliaux circulants (EPC) ont la capacité de recoloniser et réparer l'endothélium vasculaire endommagé, ce qui réduit la resténose. L'oxyde nitrique (NO) contribue à la mobilisation et l'activité fonctionnelle des EPCs, et l'oestrogène a été montré pour augmenter le taux circulant des EPCs et d'accélérer le processus de réendothélialisation par les EPCs chez la souris. En outre, le NO est important pour la transduction de la signalisation oestrogène-dépendante et la réendothélialisation. Nous avons proposé que la surexpression d'oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS), seule ou en combinaison avec un traitement à l'oestrogène, potentialiserait les effets bénéfiques des EPCs dans le cadre de la resténose.Nous avons constaté que les EPC humains natifs (hEPCs) n'ont pas d'effet sur la prolifération et la migration in vitro des cellules musculaires lisses de l'artère coronaire humaine (hCASMC), évaluées par l'incorporation de BrdU et le l'essai « wound-scratch » respectivement. En revanche, le donneur de NO SNAP a diminué de façon significative la prolifération et la migration des hCASMCs. Par la suite, des hEPCs ont été soit transfectés avec un plasmide eNOS humain ou stimulés par du 17β-estradiol (E2) avant d'être co-cultivés avec des hCASMCs. Les niveaux d'eNOS totale et phosphorylée évalués par western blot ont été augmentés de 3 - à 3,5 fois dans les hEPCs transfectés avec eNOS ou stimulés avec E2. Cela a été associé à une augmentation de 3 fois de la production de NO, mesuré par immunofluorescence avec DAF-FM diacétate (p <0,05). Des hEPCs surexprimant eNOS ont montré une augmentation du rapport Bcl-2/Bax et le marquage d'annexine V/iodure de propidium a été réduit indiquant une augmentation de la survie. Fait intéressant, nous avons observé une diminution significative (p <0,05) de la migration des hCASMC de 23% pendant la co-culture avec des hEPCs surexprimant eNOS, et de 56% avec des hEPCs stimulés avec E2. Cependant, la prolifération des hCASMC n'a été affectée ni par des hEPCs surexprimant eNOS, ni par les hEPCs stimulés avec E2. Ces résultats suggèrent que la surexpression de eNOS dans des EPCs humains augmente leur survie et améliore leur capacité à moduler la migration des hCASMC via des effets paracrines.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.119663 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Guber, Sergio |
| Contributors | Stephanie Lehoux (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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