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Characterization of the «Smpec» Knock-out mouse

The Smpec gene is expressed solely in the chondrocytes at the resting and proliferating zones but not in the hypertrophic chondrocytes. The SMPEC protein is a chondroitin sulfate proteoglycan (CS PG) composed of 121 amino acids. In silico analysis suggests it is a transmembrane protein. The purpose of this study was to characterize the Smpec knockout (KO) mouse and identify its role in skeletogenesis in vivo. To confirm the suggested topology for the SMPEC protein, immunofluorescence (IF) was performed on 4 days post natal (P4) distal femur. The protein was localized to the cell surface of resting and proliferating chondrocytes, but also accumulated in intercolumnar septum of hypertrophic chondrocytes, suggesting its shed. Alcian blue /alizarin red staining, which stains cartilage and bone respectively, was performed on arms of P4 wild-type (WT) and KO mice and there were no qualitative differences in staining intensity neither in bone nor in cartilage of KO compared to WT. However, quantitative measurement indicated that the humeri were all statistically reduced in length by 10.4% in the KO compared to the WT. As it is wellknown that the longitudinal growth of long bones is mediated through the growth plate, thereby we focused our study on this region. Safranin O/Fast green staining in P4 distal femur revealed that the chondrocyte cell density of the resting and proliferating zones appeared less in the KO than in WT littermates. Quantitative analysis confirmed the hypocellularity of these zones. However, the thickness of the hypertrophic zone was normal. The expression profile of genes known to be important in skeletogenesis and mineralization was assessed by real-time qPCR. No statistically significant changes were detected in the Smpec KO as compared to WT at the three ages analyzed (day 4, day 28 and12 months). Similarly, primary chondrocytes cultures established from KO and WT rib cages, did not present any significant changes in expression of Col2a1, Col10a1, Sox9, and Acan. Furthermore, in such cultures, extracellular matrix deposition of proteoglycanaggrecan as assessed by alcian blue staining, was not significantly altered, indicating similarity in the metabolic activity of the chondrocytes. This indicates for the first time that loss of Smpec results in mild dwarfism in mice and that its function cannot be compensated by other genes at least at neonatal ages. The mechanism by which the lack of SMPEC causes dwarfism is still unclear. / Le gène Smpec est exprimé uniquement dans les chondrocytes de la plaque de croissance à l'exception de la zone hypertrophiée. La protéine SMPEC est une protéoglycane contenant de la chondroïtine sulfate (CS PG) et composée de 121 acides aminés. Une analyse in silico indique qu'il s'agit d'une protéine transmembranaire. Le but de cette étude était de caractériser le phénotype d'un modèle de souris dont le gène Smpec a été inactivé (KO), en particulier l'effet sur la formation du squelette. Pour confirmer la topologie proposée pour SMPEC, elle a été localisée par immunofluorescence (IF) sur des fémurs au jour 4 postnatal (P4). La protéine est présente à la surface de la cellule dans la zone superficielle et la zone de prolifération. Par contre, elle s'accumule aussi dans la matrice extracellulaire de la zone hypertrophiée, entre les colonnes de chondrocytes. Ce résultat suggère que le domaine extracellulaire est coupé et libéré dans la matrice à la zone de transition. Une coloration avec le bleu alcian et l'alizarine rouge, a été réalisée pour visualiser le cartilage et l'os dans les humérus au jour 4 postnatal. Aucune différence qualitative dans l'intensité de la coloration, ni dans les os ni dans le cartilage n'a été détectée dans la souris KO par rapport à la souris sauvage. Cependant, une mesure quantitative a révélé que plusieurs parametres osseux sont significativement diminues dans le KO, entre autre la longueur totale qui est reduite de 10.4% par rapport a la souri sauvage. Étant donné que la plaque de croissance est responsable de la croissance longitudinale des os longs, nous avons ensuite plus spécifiquement investigué cette région. Une coloration avec la safranine O a permis de révéler la densité cellulaire dans les zones superficielle et de prolifération était diminuée dans la souris mutante. Cependant, l'épaisseur de la zone de chondrocytes hypertrophiés est demeurée inchangée. Le profil d'expression de plusieurs gènes connus pour être importants dans squelettogenèse et la minéralisation est aussi restée inchangée dans les plaques de croissance isolées à partir des femurs in vivo, et dans les cultures de chondrocytes in vitro. Aussi, les depots de proteoglycan aggrecan dans la matrice extracellulaire in vitro n'a pas été modifiée indiquant la similitude de l'activité métabolique des chondrocytes KO et sauvages. Ceci indique pour la première fois que la perte de fonction du gène Smpec in vivo cause un nanisme léger, mais que le mécanisme en cause demeure indéterminé.

Identiferoai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.119681
Date January 2013
CreatorsAljebali, Latifa
ContributorsPierre Moffatt (Internal/Supervisor)
PublisherMcGill University
Source SetsLibrary and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada
LanguageEnglish
Detected LanguageFrench
TypeElectronic Thesis or Dissertation
Formatapplication/pdf
CoverageMaster of Science (Department of Human Genetics)
RightsAll items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated.
RelationElectronically-submitted theses.

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