The vertebrate body is patterned asymmetrically along the left-right axis. Left-right patterning is required to establish correct asymmetric organ formation and positioning, and ultimately it is essential for normal physiological functioning. Misregulation in this process can lead to severe physiological defects in multiple organs, including the heart and gut. Pitx2c is a paired-like homeodomain transcription factor and is crucial for translating left-right signals into asymmetric morphogenesis. It is asymmetrically expressed in the left lateral plate mesoderm and continues to be expressed on the left side of organ primordia that are destined to become asymmetrically formed or positioned organs. Previous work studying Pitx2c has demonstrated its evolutionarily conserved role in left-right patterning. While the homeodomain is important for Pitx2c's function, our lab identified a putative interaction domain in the N-terminus of Pitx2c that is required for its function in left-right patterning. To further characterize the role of Pitx2c, I used a yeast two-hybrid screen to identify candidate protein interaction partners of its N-terminus. Thirty-two candidates were identified from the screen. Candidates that were isolated at least twice were prioritized for further analysis. After eliminating non-coding clones, false positive interactions, and confirming interactions of the candidate putative interaction domains with the Pitx2c N-terminus in yeast, six candidates remained: Anti-silencing function 1 homolog B (S. cerevisiae; Asf1b), Eukaryotic translation initiation factor 3, subunit A (Eif3a), Eukaryotic translation initiation factor 3, subunit M (Eif3m), Niemann-Pick C type 2 (Npc2), Serine/arginine-rich splicing factor 2 (Srsf2), and Serine/arginine-rich splicing factor 15 (Srsf15). mRNA Expression patterns of these six Pitx2c candidate protein interaction partners was analyzed by whole mount in situ hybridization and compared to Pitx2c expression patterns. All candidates were expressed symmetrically in the embryo, including tissues where Pitx2c is asymmetrically expressed. In the chick embryo, Npc2 and Srsf2 were expressed in a tissue-specific manner from HH stage 10 to HH stage 26, while Eif3a and Eif3m were broadly expressed throughout the embryo from HH stage 10 and only became enriched in particular tissues at HH stage 24 to HH stage 26. All candidates were coexpressed with Pitx2c in the looped heart tube. Only Srsf2 was coexpressed with Pitx2c in the lateral plate mesoderm. The known functions of these candidates are consistent with the known role of Pitx2c in transcriptional regulation and suggests new roles for Pitx2c in mRNA processing and translational regulation during left-right patterning. / Le corps des vertébrés est structuré asymétriquement le long de l'axe gauche-droit. La latéralité est requise afin d'établir la formation des organes ainsi que leur positionnement qui, ultimement, sont essentielles pour un fonctionnement physiologique normal des vertébrés. Lors de ce processus, une mauvaise régulation peut causer des troubles physiologiques sévères dans plusieurs organes incluant le cœur et l'intestin.Le facteur de transcription homéodomaine Pitx2c joue un rôle essentiel lors de la traduction des signaux gauche-droit en morphogénèse asymétrique des organes. Pitx2c est exprimé de façon asymétrique dans le mésoderme de la plaque latérale gauche et continu d'être exprimé du côté gauche des futurs organes asymétriques. Quelques études ont démontré que Pitx2c a un rôle qui est conservé lors de l'évolution dans la latéralité. Le rôle de l'homéodomaine est important pour la fonction de Pitx2c et nous avons démontré dans notre laboratoire qu'un domaine d'interaction de la partie N-terminale de Pitx2c est aussi important pour sa fonction lors de la latéralité.Afin de caractériser d'avantage le rôle de Pitx2c, j'ai utilisé la méthode de double hybride afin d'identifier des protéines candidates d'interaction avec la partie N-terminale de Pitx2c. Trente-deux candidats ont été sélectionnés. De ce nombre, les faux positifs ainsi que les candidats qui représentent région la non-codante d'une protéine ont été supprimés ce qui a permis de réduire la liste à six candidats : Anti-silencing function 1 homolog B (S. cerevisiae; Asf1b), Eukaryotic translation initiation factor 3, subunit A (Eif3a), Eukaryotic translation initiation factor 3, subunit M (Eif3m), Niemann-Pick C type 2 (Npc2), Serine/arginine-rich splicing factor 2 (Srsf2), ainsi que Serine/arginine-rich splicing factor 15 (Srsf15).Les patrons d'expression des six protéines candidates potentielles d'interaction avec Pitx2c ont été examinés par hybridation in situ et ont été comparé avec le patron d'expression de Pitx2c. Chez tous les candidats, l'expression asymétrique dans les embryons de poulet a été observée incluant dans les tissus où Pitx2c est aussi exprimé asymétriquement. Npc2 et Srsf2 sont exprimés de façon spécifique dans certains tissus à partir du stade HH10 chez le poulet. Eif3a et Eif3m sont largement exprimés dans les embryons à partir du stade HH10 mais leur expression est enrichie dans certains tissus à partir du stade HH22. L'expression de tous les candidats coïncide avec celle de Pitx2c dans la courbure du tube cardiaque. Seulement l'expression de Srsf2 coïncide avec celle de Pitx2c dans le mésoderme de la plaque latérale gauche. Les fonctions des différents candidats suggèrent que ces partenaires potentiels d'interactions de la partie N-terminale de Pitx2c pourraient jouer un rôle important lors de la régulation de la transcription, la formation de l'ARN messager et la régulation de la traduction lors de la latéralité.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.123305 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Wong, Shian Yea |
| Contributors | Aimee Ryan (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Human Genetics) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically submitted theses |
Page generated in 0.0028 seconds