Gamma-tubulin is a conserved component of microtubule-organizing center (MTOC) and functions in microtubule nucleation in vivo. Recent studies suggest that gamma-tubulin might have additional roles in microtubule organization. For example, the deletion of DSYL domain at the acidic unstructured C-terminal of Tub4 abrogates the Kar9-dependent pathway for spindle positioning. In vivo, gamma-tubulin is modulated via phosphorylation and the tyrosine 445 residue was found to be one of the phosphorylation sites of Tub4. In addition, the phospho-mimetic mutation (tub4-Y445D) causes defects in chromosome segregation. We hypothesize that differential phosphorylation of Tyr445 could control the non-canonical functions of Tub4. If this is the case, it is expected that phospho-mimetic and phospho-inhibiting mutants at Tyr445 would yield specific defects that report on the distinctive functions of Tub4. / In order to test this hypothesis, Genome Scale Structure Function (GSSF) analysis has been performed. This method consists of two main steps, first high-throughput Synthetic Genetic Array (SGA) analysis and second, data clustering using hierarchical algorithm. SGA is a powerful method to reveal genetic interacting partners of gene of interest. We have extended the SGA method by using known or predicted separation-of-function query alleles to cross into the deletion collection, which facilitates not only the study of essential genes but also the dissection of different functional modalities of genes. SGA analysis was conducted between a phospho-inhibiting tub4 mutant (tub4-Y445F) and ~4600 deletion mutants. Next, data clustering using hierarchical algorithm was performed on gene interaction matrix to identify major pathways that Tub4 is involved in. In addition to tub4 mutant, the GSSF analysis has been performed on conditional alleles from two different essential genes Glc7 (glc7-E101Q) and Ame1 (ame1-4), and has revealed genetic networks which recover known-regulated pathways as well as suggest new pathways that these two genes are involved. / Here, we present the GSSF analysis of the phospho-inhibiting allele tub4-Y445F. The results revealed previously known and expected pathways of gamma-tubulin including spindle positioning, actin organization, cell cycle checkpoints and interestingly, suggested new role of gamma-tubulin in DNA damage repair machinery. Preliminary data supporting the new role of gamma-tubulin in the DNA damage repair machinery is also presented, including genetic interactions with the MRX complex and HU sensitivity. / Altogether, the data outlined indicated that gamma-tubulin functions in a much more diverse network than would be expected if it were solely a MT nucleation factor. We propose that GSSF analysis on other tub4 separation-of-function mutants such as phospho-mimetic mutant tub4-Y445D will reveal how gamma-tubulin coordinates its multiple regulatory functions in cells. / La γ-tubuline est un composant du centre d'organisation des microtubules (COMT) et intervient dans la nucléation des microtubules in vivo. Des études récentes suggèrent que le rôle de la γ-tubuline pourrait s'étendre au-delà de cette fonction. Ainsi, la délétion du domaine DSYL à l'extrémité C-terminale acide et non structurée de Tub4 abolit la voie de positionnement du fuseau mitotique dépendant de Kar9. In vivo, la γ-tubuline est modulée par phosphorylation et le résidu tyrosine 445 est un site de phosphorylation de Tub4. De plus, une mutation phospho-mimétique (tub4-Y445D) provoque des défauts de ségrégation des chromosomes. Nous posons l'hypothèse que le phosphorylation différentielle de Tyr445 dicte les fonctions non-canoniques de Tub4. Par exemple, des mutants phospho-mimétiques ou inhibants la phosphorylation au site Tyr445 produiraient des défauts de diverses fonctions de Tub4. / Pour tester cette hypothèse, nous avons entrepris une étude structure-fonction à l'échelle du génome (GSSF) où une analyse du Synthetic Genetic Array (SGA) est suivie d'un regroupement des données par un algorithme hiérarchique. Le SGA est une technique permettant de révéler des interactions génétiques entre des gènes d'intérêt. Une analyse du SGA a été conduite entre un mutant de tub4 et ~4,600 mutants de délétion. Étant l'un des rares laboratoires à utiliser des mutations conditionnelles dans des analyses de SGA, nous pouvons étudier les gènes essentiels mais aussi disséquer les différentes fonctions des gènes. Dans un second temps, le regroupement des données par un algorithme hiérarchique a été réalisé à partir d'une matrice d'interactions génétiques dans le but d'identifier les principales voies d'action de Tub4. En plus de mutants tub4, une analyse GSSF a été conduite avec des allèles conditionnels des gènes essentiels Glc7 et Ame1, glc7-E101Q and ame1-4. Les réseaux d'interactions génétiques ainsi révélés comportent des voies connues pour être régulée par ces deux génes mais aussi suggèrent de nouvelles connexions. / Nous présentons ici l'analyse GSSF de l'allèle tub4-Y445F, inhibant la phosphorylation. Les résultats confirment le rôle de la γ-tubuline dans le positionnement du fuseau mitotique, l'organisation de l'actine et les points de contrôle du cycle cellulaire. Notre étude suggère que le γ-tubuline joue un rôle dans la machinerie de réparation des dommages à l'ADN. Des résultats préliminaires tels que des interactions génétique avec le complexe MRX et de test de sensibilité à HU sont présentées pour appuyer cette nouvelle fonction. Dans leur ensemble, nos données indiquent que la γ-tubuline a un rôle plus complexe que facteur de nucléation des microtubules. Nous pensons que les études GSSF d'autres allèles conditionnels de tub4 tel que tub4-Y445D (phospho-mimétique) permettront de mieux comprendre la coordination de ses multiples fonctions.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.86514 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Nguyen, Thi Thu Thao |
| Contributors | Jacalyn Vogel (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Biology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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