The inappropriate expression, localization, or activation of kidney protein kinases may precipitate renal dysplasia or cystic diseases. The expression and activation of the Ste20-like kinase, SLK, is increased during renal development and recovery from ischemic acute renal failure (ARF). Activation of SLK promotes apoptosis and, during development and healing, SLK may regulate cell growth. Alternatively, in glomerular diseases, the activation of SLK and apoptosis of glomerular epithelial cells (GEC) may be harmful and lead to sclerotic glomerular injury. The overall aim of the project is to elucidate the regulation of SLK activity in order to better understand the role of SLK in kidney development and injury. It is proposed that activation of SLK may be due to upregulation of expression, which may then favor homodimerization and autophosphorylation. Serine and threonine residues were mutated in the putative activation segment of the SLK catalytic domain. Wild type (WT) and mutant proteins were expressed in COS-1 cells or GEC. Compared with SLK WT, the S189A mutant and the T183A/S189A double mutant showed trivial in vitro kinase activity, while kinase activity was reduced significantly by the T183A mutation. Expression of SLK WT increased activation-specific phosphorylation of c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 kinase, reflecting enhanced signaling via stress kinase pathways. In contrast, activation of JNK by SLK T183A, S189A, and T183A/S189A and p38 by T183A/S189A was impaired. Similarly, expression of SLK WT stimulated activator protein-1 (AP1) reporter activity, but activation of AP1 by the three SLK mutants was ineffective. To test if homodimerization of SLK affects phosphorylation, the cDNA encoding the SLK catalytic domain (amino acids 1-373) was fused with a cDNA for a modified FK506 binding protein, Fv (SLK-Fv). After transfection, addition of AP20187 (an FK506 analog) induced regulated dimerization of SLK-Fv. AP20187-stimulated dimerization enhanced the kinase activity of SLK-Fv WT. In contrast, kinase activities of SLK-Fv T183A/S189A and activation site mutants E79A, K63R, T193A were weak, and were not enhanced after dimerization. Surprisingly, phosphomimetic mutants of SLK-Fv, including T183D, T183E, S189D, and S189E showed weak kinase activity, which was unaffected by dimerization. Co-transfection of SLK and T183A/S189A failed to silence the kinase activity of the WT in an in vitro kinase assay. Finally, apoptosis and late apoptosis were increased after expression of SLK-Fv WT, but not T183A/S189A. Thus, phosphorylation of T183, S189 and T193 plays a key role in the activation and signaling of SLK and could represent a target for novel therapeutic approaches to renal injury. / Une expression, une localisation ou une activation inappropriée des protéines kinases rénales peut provoquer une dysplasie rénale ou une maladie cystique prématurée. L'expression et l'activation de la protéine Ste20-like kinase (SLK) sont plus élevées pendant le développement des reins et durant la guérison d'une insuffisance rénale ischémique aiguë. Une activation de la protéine SLK entraîne l'apoptose des cellules in vitro et in vivo. Au cours du développement et de la régénérescence cellulaire, SLK peut réguler la croissance cellulaire. Par contre, dans les glomérulonéphrites, l'activation de la SLK et une apoptose des cellules épithéliales glomérulaires (GEC) peuvent être dommageables et peuvent provoquer des lésions glomérulaires sclérotiques. L'objectif de ce projet est d'élucider la régulation de l'activité de la SLK dans le but de mieux comprendre son rôle dans le développement et les lésions ou maladies glomérulaires rénales. Ce projet postule que l'activation de la protéine SLK peut être due à une régulation à la hausse de l'expression, qui peut alors favoriser une homodimérisation et une autophosphorylation. Pour étudier le rôle de la phosphorylation dans la régulation de l'activation, les résidus sérine (S189) et thréonine (T183) ont été mutés dans le segment putatif du domaine catalytique de la SLK. Deux mutants simples (T183A et S189A) et un double mutant (T183A/S189A) ont été créés. La forme sauvage (WT) et les mutants de la SLK ont été exprimés dans les cellules cos-1 et GEC. SLK WT phosphorylais la protéine basique de myéline (MBP) contrairement aux mutants S189A et T183A/S189A qui montraient une activité kinase in vitro non significative. La mutation T183A diminuait la phosphorylation de MBP significativement. L'analyse des voies de signalisation de la kinase N-terminal c-jun (JNK) et de la p38 par la SLK a été étudiée sachant que l'expression de la SLK WT stimule la phosphorylation de la JNK et de la p38. Tant que T183A/S189A n'a pas pu activer la JNK et la p38, les mutants T183A et S189A ont activé la JNK à un degré moindre que la SLK WT. Ces résultats démontrent que la phosphorylation de T183 et de S189 est importante pour l'activation de la SLK. De façon similaire, l'expression de la SLK WT a stimulé l'activation de la protéine activatrice 1 (AP1), un facteur de transcription de la famille c-fos et c-Jun, tandis que les trois mutants ont été incapables de stimuler AP1. Pour déterminer si l'homodimérisation de la SLK affecte la phosphorylation, l'ADN complémentaire de la SLK codant le domaine catalytique (1-373) a été fusionné avec l'ADN complémentaire d'une protéine modifiée qui s'attache à des molécules FK506 (Fv), pour créer SLK-Fv. Après la transfection, l'addition du AP20187, un analogue de FK506, induit la dimérisation de la SLK-Fv. La dimérisation occasionnée par l'AP20187 a augmenté l'activité catalytique de la SLK-Fv. Par contre, tous les mutants Fv fusionnés T183A/S189A, E79A, K63R et T193A démontraient une activité catalytique faible, que la dimérisation n'a pas pu augmenter. Ce qui est particulièrement intéressant, les mutants phosphomimétiques T183D, T183E, S189D et S189E montraient aussi une activité catalytique faible qui n'a pas été affectée par la dimérisation. Finalement, l'apoptose et la nécrose sont accrues suite à une surexpression de la SLK-Fv WT, mais pas avec le mutant T183A/S189A-Fv. Ainsi, les acides aminés K63 et E79 et la phosphorylation de T183, S189 et T193 jouent un rôle important dans la régulation de la SLK et pourraient être ciblés par des approches thérapeutiques pour le traitement des néphropathies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.97038 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Luhovy, Artem |
| Contributors | Andrey V E Cybulsky (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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