Thèse présentée en cotutelle : Doctorat en Bioingénierie (Politecnico di Milano) et Doctorat en génie des matériaux et de la métallurgie (Université Laval) / Les stratégies de livraison de gènes non viraux ont suscité un intérêt manifeste pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques ainsi que pour la recherche fondamentale et appliquée in vitro. Par rapport aux vecteurs viraux populaires, la classe des vecteurs non- viraux, comme les lipides (CLs) et les polymères (CPs) cationiques, capables de réagir spontanément avec des acides nucléiques (NAs) chargés négativement pour former des nanoparticules appelées complexes, connaît actuellement un regain d'intérêt au sein de la communauté scientifique. En effet, en plus d'être relativement sécuritaires, rentables, ils peuvent être facilement produits et fonctionnalisés, même à grande échelle. Cependant, leur efficacité est encore trop faible pour surpasser leurs homologues viraux. L'efficacité des vecteurs non viraux est un équilibre entre leur capacité à introduire des NAs dans les cellules, permettant ou inhibant ainsi leur expression, leur toxicité inhérente et leur capacité à délivrer des gènes aux cellules cibles. Ces dernières années, des efforts considérables en recherche ont donc été déployés pour développer de nouveaux moyens d'améliorer l'efficacité de cette classe de systèmes de livraison. Cette thèse de doctorat avait ainsi pour but de développer des stratégies innovantes pour améliorer l'efficacité des vecteurs non viraux. Dans ce contexte, nous avons considéré la problématique de la livraison sous deux perspectives différentes : d'une part, la modulation de la chimie du vecteur a été évaluée comme moyen de développer des transporteurs multifonctionnels avec une meilleure efficacité ; d'autre part, une stratégie de stimuler les interactions cellules-nanoparticules par modulation mécanique du comportement cellulaire sur la capacité de livraison de vecteurs non viraux a été étudiée. La première partie de cette thèse visait donc à mettre en évidence l'importance de la chimie de ces vecteurs, plus particulièrement ceux à base de lipides, sur la relation structure-fonction de ces matériaux et l'impact de la chimie du vecteur sur leur capacité ultime à livrer des gènes. Cette thèse a ensuite exploré de nouvelles façons d'améliorer les performances de la polyéthylèneimine (PEI), à savoir le vecteur polymère de référence, en configuration linéaire (lPEI) et ramifiée (bPEI). Tout d'abord, une étude approfondie de toutes les variables expérimentales qui peuvent influencer les performances des polyplexes à base de PEI, a été réalisée afin de déterminer les meilleures conditions de fonctionnement des vecteurs à base de PEI et d'améliorer la standardisation des protocoles de criblage in vitro. Ensuite, le focus a été fait sur le développement d'une approche vectorielle pour fonctionnaliser le bPEI avec des entités fonctionnelles ciblées afin d'améliorer la sélectivité du vecteur envers un type de cellule spécifique. Ainsi, il a été synthétisé une gamme de bPEI conjugués incorporant des peptides de ciblage pour délivrer sélectivement des gènes aux cellules musculaires lisses vasculaires (vSMCs). De plus, ces vecteurs de ciblage spécifique ont été incorporés dans une matrice afin de permettre leur libération locale et contrôlée pour des approches liées au domaine cardiovasculaire. Grâce à la conjugaison d'une séquence peptidique dérivée de l'élastine à la structure de la bPEI, l'efficacité du polymère sur les vSMCs a été améliorée tout en laissant les cellules non ciblées intactes. Ceci est particulièrement important pour la translation des approches non virales de livraison de gènes vers le in vivo. D'autre part, une nouvelle approche basée sur la régulation de la réponse cellulaire à l'administration de la nanoparticule a été élaborée. En effet, les cellules in vivo sont constamment exposées à différents facteurs environnementaux qui gouvernent certaines fonctions cellulaires essentielles. L'application d'un stimulus mécanique exogène en termes de sollicitation vibratoire sur des cellules en cours de transfection (processus de livraison de NAs par vecteurs non-viraux) a donc été évaluée avec des polyplexes à base de lPEI et bPEI. Étonnamment, l'efficacité des polyplexes à base d'lPEI a été grandement améliorée grâce à l'activation de certaines réponses cellulaires clés. Plus précisément, les stimulations mécaniques appliquées aux cellules ont amélioré l'internalisation des polyplexes en déclenchant l'activation de l'endocytose médiée par la clathrine (CME). Cette stratégie a mis en évidence l'importance des réponses cellulaires aux signaux exogènes sur l'internalisation et l'expression finales d'un gène d'intérêt et a ouvert la voie à une nouvelle façon de traiter la question de la livraison non virale. En conclusion, ce projet de doctorat a clairement mis en évidence la pertinence de ces approches chimiques et cellulaires comme moyens efficaces d'améliorer l'efficacité des vecteurs non viraux. En combinant les stratégies conçues dans le cadre de ce projet, il serait possible de franchir une autre étape en ce qui concerne la recherche sur l'administration de gènes non viraux. En effet, le développement d'approches multidisciplinaires tenant en compte à la fois du vecteur d'administration, de l'environnement dans lequel l'administration des gènes a lieu et de la réponse cellulaire, pourrait ouvrir la voie à des stratégies encore plus efficaces et accélérer le passage du laboratoire au patient pour cette catégorie de matériaux. / Non-viral gene delivery strategies have attracted significant interest in the development of novel therapeutic approaches as well as for basic and applied research in vitro. Compared to popular viral vectors, the class of non-viral carriers, namely cationic lipids (CLs) and polymers (CPs) able to spontaneously interact with negatively charged nucleic acids (NAs) to give nanoparticles called complexes, is now witnessing a surge of interest within the scientific community because they are relatively safe, cost-effective, and they can be easily produced and functionalized even at large scale. However, their efficiency in achieving the delivery tasks is still too low to outperform their viral counterparts. The efficacy of non-viral vectors is a tradeoff between their ability to drive NAs into cells, thus allowing/inhibiting their expression, their inherent toxicity, and their ability to deliver genes to target cells. Extensive research effort has thus been put into developing novel ways to improve the efficiency of such a class of delivery systems. In this context, my Ph.D. aimed at developing innovative strategies to improve non-viral vector effectiveness. To this purpose, we dealt with the delivery issue from two different perspectives: on one hand, the modulation of the vector chemistry was disclosed as a way to develop multifunctional carriers with improved effectiveness; on the other hand, we sought to improve cell-(nano)particles' interactions through the mechanical modulation of the cell behavior in response to the delivery of non-viral vectors. The first part of this thesis was thus aimed at highlighting the importance of vector chemistry on the structure-function relationship of such kinds of materials, with a focus on lipid-based carriers. Furthermore, I dealt with the characterization of a novel class of lipid-based vectors to investigate the interconnection between their structure and ultimate gene transfer ability. This thesis next explored novel ways to improve the performances of polyethyleneimine (PEI), namely the gold standard polymer vector, both in linear (lPEI) and branched (bPEI) topography. First, a thorough investigation of all the experimental variables affecting the performances of PEI-based polyplexes was carried out to disclose the best working conditions of PEI-based carriers and improve the standardization of in vitro screening protocols. Next, I focused on the development of a vector-based approach to functionalize bPEI with targeting moieties to improve the vector's selectivity towards a specific cell type. We thus synthesized a series of bPEI conjugates incorporating targeting peptides to selectively deliver genes to vascular smooth muscle cells (vSMCs). Moreover, the targeting vectors were incorporated into a polyplex releasing matrix to enable their local and controlled release for cardiovascular-related approaches. Through the conjugation of an elastin-derived peptide sequence to the bPEI structure, we were able to improve the polymer's effectiveness on target vSMCs while leaving off-target cells unaffected, a fact that is especially relevant for the translation of non-viral gene delivery approaches in vivo. On the other side, a novel strategy based on the regulation of cell response to the delivery of nanoparticles was devised. Indeed, cells in vivo are constantly subjected to different environmental cues that govern some key cell functions. We thus investigated the application of an exogenous mechanical stimulus in terms of vibrational loading to cells undergoing transfection (i.e., the delivery of NAs utilizing non-viral vectors) using lPEI and bPEI-based polyplexes. Interestingly, mechanical stimuli applied to cells improved polyplex internalization by triggering the activation of clathrin-mediated endocytosis (CME), thus leading to greater transfection outcomes. This strategy outlined the importance of cell responses to exogenous cues on the ultimate internalization and expression of a gene of interest and set the stage for a novel way to deal with the non-viral delivery issue. Overall, the big picture drawn by this Ph.D. project highlighted the suitability of chemical-based approaches and cell-based approaches as promising ways to improve non-viral vector effectiveness. Further improvement in non-viral gene delivery research might be achieved by combining the strategies devised in this project. The development of multidisciplinary approaches taking into account both the delivery vector, the environment in which the delivery of genes takes place, and the cell response may thus pave the way to ever more effective strategies, and expedite the translation from the bench to the bedside of these materials.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/118703 |
| Date | 09 June 2023 |
| Creators | Ponti, Federica |
| Contributors | Mantovani, D. (Diego), Candiani, Gabrièle |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xxiv, 244 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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