Thèse ou mémoire avec insertion d’articles / La complexité et le coût de production à grande échelle des rAAV présentent un sérieux obstacle à la commercialisation des thérapies géniques. Des améliorations dans la fabrication des vecteurs rAAV sont réalisables à l'aide de lignées cellulaires d'empaquetage ou productrices, qui, dans le cas des rAAV, sont difficiles à générer en raison de la toxicité des protéines AAV Rep et des gènes auxiliaires d'adénovirus nécessaires à la production. Le gène AAV REP code pour quatre protéines Rep (Rep -78, -68, -52, -40) qui ont de multiples fonctions et rôles qui se chevauchent dans la production d'AAV. Les gènes auxiliaires adénoviraux utilisés dans la production de rAAV sont E2A, E4 et VA et jouent des rôles uniques dans le cycle de vie de l'AAV. Pour générer une lignée cellulaire d'empaquetage de AAV, tous ces composants doivent être intégrés de manière stable dans le génome des cellules. L'expression doit être étroitement régulée en raison de la cytotoxicité et lorsque l'expression est induite, les niveaux doivent être adéquats pour soutenir la production de rAAV. Une telle lignée cellulaire d'empaquetage serait un point de départ pour créer une lignée cellulaire productrice pour la production d'un sérotype spécifique d'AAV et d'un gène thérapeutique spécifique en intégrant un gène CAP d'intérêt et une séquence thérapeutique flanquée d'ITR. Le travail présenté dans cette thèse décrit le processus de génération et de caractérisation des lignées cellulaires d'empaquetage 293SF-CymR/λR-GyrB AAV exprimant les protéines Rep et les conceptions et tentatives de création d'une lignée cellulaire d'empaquetage Rep/Helper. Nous avons identifié et intégré avec succès une combinaison de deux protéines Rep (Rep68 et Rep40) exprimées à partir de deux promoteurs inductibles par le cumate et la coumermycine. Les lignées cellulaires créées ont démontré leur capacité à produire des titres à des niveaux comparables aux productions par transfection transitoire avec les lignées cellulaires parentales et se sont avérées stables en culture sans sélection. Nous décrivons également notre conception et nos travaux de recherche sur la faisabilité pour générer des lignées cellulaires d'emballage Rep/Helper où les séquences codant pour les protéines E4orf6 et E2A DBP sont également exprimées à partir de promoteurs inductibles par le cumate et la coumermycine. / The complexity and cost of large-scale rAAV production present a serious obstacle in commercialization of rAAV gene therapies. Improvements in rAAV vector manufacturing are achievable using packaging or producer cell lines, which in case of rAAVs are difficult to generate due to the toxicity of AAV Rep proteins and adenovirus helper genes required for production. The AAV REP gene encodes four Rep proteins (Rep -78, -68, -52, -40) which have multiple overlapping functions and roles in AAV production. The adenoviral helper genes used in rAAV production are E2A, E4 and VA and serve unique roles in the AAV lifecycle. To generate an AAV packaging cell line all these components must be stably integrated into the genome of the cells. Expression must be tightly regulated due to cytotoxicity and when expression is induced, the levels must be adequate to support rAAV production. Such a packaging cell line would be a starting point to create a producer cell line for production of a specific serotype of AAV and specific therapeutic gene by integrating a CAP gene of interest and ITR flanked therapeutic sequence. The work presented in this thesis describes the process of generating and characterizing 293SF-CymR/λR-GyrB AAV packaging cell lines expressing the Rep proteins and the designs and attempts of creating a Rep/Helper packaging cell line. We successfully identified and integrated a combination of two Rep proteins (Rep68 and Rep40) expressed from two cumate and coumermycin inducible promoters. The created cell lines demonstrated ability to produce titers at levels comparable to transient transfection productions with the parental cell lines and were shown to be stable in culture without selection. We also describe our design and investigation into the feasibility of Rep/Helper packaging cell line generation where the E4orf6 and E2A DBP protein coding sequences are also expressed from cumate and coumermycin inducible promoters.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/124345 |
| Date | 08 September 2023 |
| Creators | Jalsic, Lovro |
| Contributors | Gaillet, Bruno, Gilbert, Rénald |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xviii, 172 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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