Les primates représentent un modèle animal idéal pour étudier la stéroïdogénèse puisqu'ils sécrètent, comme les humains, de grandes quantités de dehydroepiandrosterone (DHEA) et de DHEA-sulfate (DHEA-S). La transformation de DHEA et de DHEA-S en androgènes et estrogènes actifs dans les tissus périphériques cibles dépend du niveau de l'expression des diverses enzymes stéroïdogéniques dans chaque type de cellules. Afin de mieux comprendre la formation et l'inactivation périphériques des androgènes et des estrogènes chez le singe, nous avons isolé chez le singe Macaca fascicularis, les orthologues des enzymes humaines par PCR, en utilisant des oligonucléotides dégénérés. Nous avons étudié d'une façon quantitative, la distribution de l'ARN messager des enzymes principales de biosynthèse et de métabolisme pour les stéroïdes chez le singe de cynomolgus, avec la méthode de PCR en temps réel. Finalement, nous avons caractérisé l'activité enzymatique des enzymes clés chez le singe de cynomolgus, soit la 311-HSD, la 1713-HSD du type 12 et les membres de la famille d'AKR 1C (la 3a-HSD, le type 5 1713- HSD et la 20a-HSD). Notre étude montre qu'il existe une forme unique de 3P-HSD chez le Macaca fascicularis, tandis que chez l'humain 2 isoformes sont présents de façon spécifique au tissu. La quantification des niveaux d'expression de l'ARNm a montré que l'enzyme est fortement présent dans les tissus stéroïdogénique classiques et plusieurs tissus périphériques. Aussi, les résultats suggèrent qu'une défecience en 313-11SD, en plus de l'hyperplasie congénitale surrénalienne, des maladies secondaires liées à une insuffisance de métabolisme stéroïde dans les tissus périphériques tels que la peau, les glandes mammaires, la prostate, et le cerveau. Un fragment de la région codante cADN de la 17(3-HSD du type 12 a été isolé par RT-PCR dans l'ARNm de foie de Macaca fascicularis. En utilisant les cellules HEK-293 qui expriment la 1713-HSD type 12 de Macaca fascicularis par transfection stable, nous avons montré que l'enzyme catalyse efficacement et sélectivement la transformation d'El en E2. En plus, l'ARNm de la 17[3-HSD12 de Macaca fascicularis est exprimé de façon ubiquiste, avec les niveaux les plus élevés trouvés dans le cervelet, le rate, et la surrénale. Ces résultats suggèrent fortement que cette enzyme est impliqué dans la biosynthèse de l'estradiol à la suite de l'étape de la transformation de 4-androstène-3,17-dione en estrone par l'aromatase. En utilisant des amorces spécifiques, nous avons isolé les fragments d'ADN complémentaire encodant les membres de famille d'aldo-keto réductases (AKR1C) chez le singe Macaca fascicularis, soit la 3a-HSD, le type 5 17S-HSD et la 20a-HSD. L'identité de chaque clone a été déterminée par la caractérisation de l'activité de l'enzyme exprimée par transfection stable dans les cellules HEK-293. La comparaison des caractéristiques enzymatiques de la famille AKR1C de Macaca fascicularis avec celles des orthologues d'humain et de souris montre différentes spécificités de substrat entre les espèces. La quantification des niveaux d'expression l'ARNm de la famille AKR1C de Macaca fascicularis montre que 1) la 3a-HSD est spécifique pour le foie, 2) le type 5 170-HSD est principalement trouvé dans le rein et le foie, et 3) 20a-HSD est très fortement exprimée dans le rein, l'estomac et le foie. L'expression des enzymes est en accord avec les fonctions de ces enzymes. / Human and some other primates are unique in having adrenals that secrete large amounts of dehydroepiandrosterone (DHEA) and its sulfated derivative DHEA-sulfate (DHEA-S). The transformation of DHEA and DHEA-S into active androgens and /or estrogens in peripheral target tissues depends on the expression of the various steroidogenic and metabolizing enzymes in each cell type. Since monkeys produce high levels of circulating DHEA and DHEA-S like humans, they represent an ideal animal model for studying steroidogenesis in humans. To gain more knowledge about the peripheral formation and inactivation of androgens and estrogens in the monkey, we isolated the cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) orthologs of human enzymes by PCR-based cloning using degenerate oligonucleotides. Each clone was verified by automated dideoxynucleotide DNA sequencing. We also examined quantitatively the distribution of mRNAs of key steroidogenic and steroid metabolizing enzymes in the Macaca fascicularis using RealTime PCR. Furthermore, we characterized the enzymatic activity of the key enzymes, namely 313-HSD, type 12 1713-11SD and the members of the AKR IC family, namely 3a-HSD, type 5 1711-HSD and 20a-HSD. A unique isoform of Macaca fascicularis 315-HSD has been isolated by RT-PCR. Phylogenetic analysis suggests that Macaca fascicularis 313-HSD is the ortholog of human type 2 313-HSD. In addition, this enzyme shows a similar affinity to both 3H-Preg and 3H-DHEA. The quantification of mRNA expression levels showed that the enzyme is widely presented in classic steroidogenic tissues and several peripheral tissues. Thus the results suggest that deficiencies in 313-HSD enzyme would cause, in addition to congenital adrenal hyperplasia, secondary diseases related to a deficiency of steroid metabolism in the peripheral tissues such as skin, mammary glands, prostate, and brain. A fragment of the encoding region of type 12 1713-HSD cDNA was isolated by RT-PCR in Macaca fascicularis liver mRNA. Using HEK-293 cells which stably express Macaca fascicularis type 12 1715-HSD, we found that the enzyme catalyzes efficiently and selectively the transformation of El into E2. In addition, Macaca fascicularis 1713- HSDI2 mRNA is broadly expressed in all tissues examined, with the highest levels found in the cerebellum, spleen, and adrenal. These results strongly suggested that this enzyme act as a partner of aromatase in the formation of active estrogen in various tissues. Using isoform-specific primers, the cDNA fragments of Macaca fascicularis AKRIC family members, namely 3a-HSD, type 5 170-HSD and 20a-HSD, have been isolated. The identity of each clone was determined by substrate specificities using HEK-293 cells stably expressing the enzymes. Comparison of the enzymatic characteristics of Macaca fascicularis AKRIC family with human and mouse orthologs shows different substrate specificities between species. Quantification of mRNA expression levels of Macaca fascicularis AKRIC family shows that 1) the 3a-HSD is liver specific, 2) the type 5 170- IISD is mainly found in the kidney and liver, and 3) 20a-HSD is very highly expressed in the kidney, stomach and liver. Such tissue-specific expression patterns are in agreement with the metabolism function of the enzymes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/19034 |
| Date | 12 April 2018 |
| Creators | Liu, Hong |
| Contributors | Luu The, Van |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | xiv, 177 f., application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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