L’effet de proximité est essentiel à la réussite de la stratégie thymidine kinase (HSV-tk)/ganciclovir (GCV) dans le traitement du cancer. Cette propriété correspond au transfert de GCV phosphorylé des cellules tumorales HSV-tk+ vers les cellules tumorales HSV-tk–, et est essentiellement médiée par les jonctions gap (JGs) constituées de molécules de connexine (Cx). Une perte d’expression et/ou une localisation périnucléaire des connexines est souvent décrite dans les tumeurs, ce qui pourrait conduire, en théorie, à une diminution de l’efficacité du traitement HSV-tk/GCV. L’approche HSV-tk/GCV a été testée au cours d’essais cliniques pour le traitement du glioblastome bien que l’expression de la Cx43 (principal constituant des JGs dans les astrocytes) ne soit parfaitement définie. Au cours de mes travaux, l’expression de la Cx43, sa localisation et sa fonctionnalité ont été étudiées dans des lignées établies, des biopsies et des cultures primaires de glioblastome. Dans les trois lignées immortalisées de glioblastome étudiées, la Cx43 se retrouve essentiellement localisée dans les endosomes et les lysosomes comparativement aux cellules HeLa/Cx43 qui présentent une localisation membranaire de la Cx43. Des JGs ont été observées dans la lignée U87, mais très peu dans les lignées SKI-1 et U251. De façon surprenante, les lignées SKI-1 et U87 présentent une capacité jonctionnelle supérieure à celle des cellules HeLa/Cx43. De plus, un important effet de proximité a pu être mesuré dans les cellules SKI-1 et U87 suite au traitement par le GCV. L’utilisation d’un inhibiteur spécifique de la perméabilité des JGs a confirmé que l’effet de proximité induit dans ces lignées est principalement dû aux JGs. De plus, la transfection d’un mutant dominant négatif de la Cx43 ou de siARN spécifiques des ARNm de la Cx43 a permis d’identifier la Cx43 comme le principal constituant des JGs dans ces lignées de glioblastome. L’expression de la Cx43 a été mesurée sur soixante-quatorze biopsies de glioblastome. Si son expression est souvent plus faible que dans le tissu sain, seulement 23% des échantillons sont dépourvus de Cx43. Huit lignées primaires ont été dérivées de résections de patients, et sept d’entre elles expriment la Cx43, cependant à différents niveaux d’intensité. Quatre lignées démontrent une localisation cytoplasmique de la Cx43. Malgré la localisation cytoplasmique prédominante de la Cx43, ces cellules sont capables de communiquer entre elles efficacement comme l’essai de double marquage en cytométrie de flux l’a démontré. Un vecteur lentiviral contenant le gène HSV-tk a été construit afin de mener les tests d’effet de proximité. Il a ainsi été mis en évidence que quelle que soit la localisation de la Cx43, l’effet de proximité est significatif dans toutes les lignées exprimant la Cx43 et inexistant lorsque la Cx43 n’est pas présente. Ces résultats démontrent que la Cx43 est exprimée dans la majorité des glioblastomes. La Cx43 peut être exprimée dans les lignées établies et les lignées primaires de glioblastome au niveau de la membrane plasmique ou dans le cytoplasme. Cette localisation aberrante ne bloque pas le transfert intercellulaire de molécules, ce qui suggère que les rares JGs présentes à la surface sont hautement fonctionnelles. Ces résultats indiquent que l’approche HSV-tk/GCV est un candidat valable pour le traitement du glioblastome, contrairement à d’autres tumeurs pour lesquelles la perte d’expression de Cx est bien documentée. Il serait ainsi intéressant que l’expression de la Cx43 soit étudiée dans les biopsies utilisées lors du diagnostic et constitue ainsi un prérequis pour le recrutement des patients lors d’essais cliniques. / The bystander effect is essential to the success of the Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk)/ganciclovir (GCV) strategy for cancer therapy. It consists of the transfer of phosphorylated GCV from HSV-tk+ cells to neighboring HSV-tk- cells, and it is mainly mediated via gap junctions that are made up of connexin molecules (Cx). Down-regulation and/or perinuclear localization of Cxs are common in tumors, and in theory it should decrease the efficacy of the HSV-tk/GCV treatment. The HSV-tk/GCV approach has been tested in glioblastoma patients although the status of Cx43 expression (the Cx member expressed in astrocytes) is unclear in this tumor type. In this study, we have carefully evaluated the Cx43 expression, specific localization and functionality in glioblastoma cell lines, biopsies and primary glioblastoma cell cultures. In the glioblastoma cell lines studied (SKI-1, U251 and U87), Cx43 accumulated mainly in late endosomes and lysosomes as compared to HeLa/Cx43 transfected cells that displayed Cx43 at the cellular membrane. Gap junctions were observed in U87 cells, but very few or rare plaques were present at the surface of SKI-1 and U251 cells, respectively. Surprisingly, calcein, a dye commonly used to assess the functionality of gap junctions, was able to diffuse more efficiently within U87 and SKI-1 cells than in HeLa/Cx43 cells. Furthermore, a strong bystander effect was mediated by HSV-tk+ SKI-1 and U87 cells treated with GCV. The use of a specific inhibitor of gap junction permeability, confirmed that the bystander effect in these cell lines was mainly due to gap junctions. Moreover, transfection of a Cx43 dominant negative mutant and specific siRNA against Cx43 mRNA defined this Cx subtype as the major component of gap junctions in these glioblastoma cell lines. The level of Cx43 expression was next assessed in seventy-four glioblastoma biopsies. Cx43 expression was mainly lower than in normal tissue, but only 23% of the glioblastoma samples studied lacked Cx43 expression. Eight glioblastoma primary cultures were derived from surgical resection, and seven of them expressed Cx43, although at different levels. A cytoplasmic localization of Cx43 was also observed in four primary cultures. Despite this predominant intracellular accumulation of Cx43, cells were able to communicate in an efficient manner as demonstrated with a dye transfer assay. A lentiviral vector containing HSV-tk has been constructed and bystander effect experiments with these primary glioblastoma cells were carried out. We noticed that the bystander effect was significative in primary cells expressing Cx43 wherever the Cx43 was localized, and no bystander effect was detected in cells without Cx43 expression. Our results indicate that Cx43 is expressed in the majority of glioblastomas. Cx43 can be found in glioblastoma cell lines and primary cultures at the cell surface, but also in perinuclear areas. This aberrant localization of Cx43 did not prevent the diffusion of molecules, suggesting that the few gap junction plaques present in glioblastoma cells are highly functional. These results suggest that glioblastoma is a suitable candidate for the HSV-tk/GCV approach contrary to some other tumor types in which the lack of Cx has been well documented. According to these results, the level of Cx43 should be tested in patient biopsies used for diagnostics and considered for patient enrollment in clinical trials.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/25648 |
| Date | 20 April 2018 |
| Creators | Carrondo Cottin, Sylvine |
| Contributors | Caruso, Manuel |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xxiii, 178 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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