Le virus du papillome humain (VPH) est l'agent étiologique du cancer du col de l'utérus, d'un certain nombre d'autres cancers anogénitaux et d'un sous-groupe de cancers de la tête et du cou. Les VPH à haut-risque sont nécessaires au développement de ces cancers, mais les cellules infectées doivent acquérir d'autres mutations pour devenir cancéreuses. Dans une cellule saine, l'apparition d'altérations génétiques est contrôlée par des voies de signalisation sophistiquées qui détectent, signalent et réparent les dommages à l'ADN. Parmi ces dommages, les cassures double brin de l'ADN (DSBs) sont particulièrement nocives pour la survie cellulaire, car si elles ne sont pas réparées, elles peuvent conduire à l'apparition de mutations et dans des cas extrêmes à la mort cellulaire. Notre objectif principal était de comprendre les mécanismes menant à la dérégulation des voies de réparation des DSBs dans les cellules VPH-positives. Notre hypothèse est que l'interférence du VPH avec certains facteurs perturbe la réparation des DSBs et donc la stabilité du génome de la cellule hôte, ce qui peut conduire au développement de cancers. Nos observations ainsi que celles d'autres groupes ont permis de montrer que les cellules cancéreuses VPH-positives accumulent de manière excessive de foyers nucléaires 53BP1 (53BP1-NBs, 53BP1 nuclear bodies), suggérant que les cellules sont soumises à des niveaux élevés de stress réplicatif et que le virus interfère avec la réparation des cassures d'ADN en phase S/G2. De plus, nous avons démontré que RNF168, une ubiquitine E3-ligase impliquée dans la réparation des DSBs, est essentielle à l'amplification du génome viral dans les kératinocytes en différenciation et que la protéine est ciblée directement par l'oncoprotéine E7 des VPHs à haut risque. Cette interaction a lieu via un domaine de 40 acides aminés conservé et jusqu'alors non caractérisé de RNF168, le E7BD (E7-binding domain). L'interaction avec E7 affecte la fonction de RNF168 au DSBs, révélant un mécanisme par lequel une protéine virale contribue directement à l'acquisition d'instabilité génomique. Comme la liaison de E7 au E7BD entrave la fonction de RNF168 aux DSBs, nous pensons que ce domaine joue un rôle clé dans la régulation des fonctions de RNF168. Afin de déterminer la fonction du E7BD, nous avons optimisé une méthode de « marquage de proximité » basée sur l'utilisation de la protéine TurboID, afin de déterminer l'interactome de RNF168 dépendant de ce domaine. La biotine ligase TurboID qui agit dans des intervalles de temps très courts nous a permis de visualiser les interactions lors du recrutement des facteurs de réparation aux dommages, un processus extrêmement rapide. Ainsi nous avons pu valider l'utilisation de TurboID pour établir l'interactome des protéines impliquées dans la réparation des DSBs telles que RNF168. De plus, nous avons identifié plusieurs nouveaux partenaires de l'E3-ligase qui sont perdus lorsque le E7BD est absent. Par la suite, l'impact de certains de ces interacteurs sur les fonctions de RNF168 a été évalué par une approche d'ARN interférence. Nous avons ainsi pu identifier un nouvel interacteur de RNF168, l'hexokinase HK1, qui régule les quantités de RNF168 disponible dans la cellule. Finalement, nous avons décidé de tirer profit de cette approche et développé un système permettant la détection de protéines faiblement exprimées ou de locus d'ADN spécifiques à l'aide de la protéine TurboID. Nous avons démontré que l'utilisation de TurboID-RNF168 permet de visualiser le recrutement de RNF168 à différents types de dommages sans affecter la dynamique de réparation des DSBs. De plus, l'utilisation de TurboID-dCas9 nous a permis de visualiser en immunofluorescence des loci répétés tel que les télomères, mais également l'ADN viral intégré dans le génome de cellules cancéreuses VPH-positives. Ainsi ce projet a contribué à l'amélioration des connaissances sur les processus de maintien de la stabilité génomique dans les cellules infectées par le VPH et nous pensons que les découvertes présentées dans ce travail contribuent à la compréhension de la régulation de protéines cellulaires comme RNF168. / The human papillomavirus (HPV) is the etiological agent of cervical cancer, a subset of anogenital cancers as well as head and neck cancers. High-risk HPV is necessary for the development of cancers, but infected cells must acquire additional mutations to become cancerous. In a normal cell, the acquisition of genetic alterations is controlled by numerous signaling pathways that detect, signal, and repair DNA damage. Among those, DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly dangerous. If left unrepaired, they can lead to the acquisition of mutations and ultimately to cell death. Our main objective was to understand the mechanisms leading to the deregulation of DSBs repair pathways in HPV-positive cells. We hypothesize that HPV components can interfere with DSBs repair and therefore, with the stability of the host cell genome, which leads to cancer development. Our observations and those of other groups have shown that HPV-positive cancer cells present an abnormal accumulation of 53BP1-NBs, suggesting that the cells are subjected to high levels of replicative stress and that the virus interferes with the repair in the S / G2 phase of the cell cycle. In addition, we have demonstrated that RNF168, a ubiquitin E3-ligase involved in the repair of DSBs, is essential for the amplification of the viral genome in differentiating keratinocytes and that the protein is directly targeted by the oncoprotein E7. This interaction occurs via a conserved and uncharacterized 40 amino acid domain of RNF168, the E7BD (E7-binding domain). The interaction with E7 affects the function of RNF168 at DSBs, revealing a mechanism by which a viral protein directly contributes to the acquisition of genomic instability. Furthermore, the binding of E7 to the E7BD hinders the function of RNF168 at DSBs, suggesting that this domain plays a key role in the regulation of RNF168 functions. To determine the role of the E7BD, we optimized a method of proximity labeling using the TurboID protein to determine the RNF168 E7BD-dependent interactome. The TurboID biotin ligase biotinylated proximal proteins in very short time intervals allowed us to visualize the interactions during the recruitment of DNA damage repair factors. We were thus able to validate the use of TurboID to establish the interactome of proteins involved in DSBs repair such as RNF168. In addition, we have identified several new partners of the E3-ligase that are lost in the absence of the E7BD. Subsequently, the impacts of some of these interactors on the functions of RNF168 were evaluated by an RNA interference approach. This enabled us to identify the hexokinase HK1 as a new partner and regulator of RNF168. Finally, we decided to take advantage of this approach and developed a system for the detection of weakly expressed proteins or specific DNA loci using the TurboID protein. We demonstrated that TurboID-RNF168 allows the visualization of the protein recruitment to different types of DNA damage without affecting the dynamics of DSBs repair. In addition, we used TurboID-dCas9 to visualize repeated loci such as telomeres, and viral DNA integrated into the genome of HPV positive cancer cells by immunofluorescence. In conclusion, the results present in this thesis will contribute to our knowledge of genomic stability maintenance in HPV infected cells and our understanding of the regulation of cellular proteins such as RNF168.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/70592 |
| Date | 02 August 2022 |
| Creators | Sitz, Justine |
| Contributors | Fradet-Turcotte, Amélie |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xviii, 258 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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