Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer SNP-Genotypisierungsmethode
mit auf Mikroarrays immobilisierten PCR-Produkten. Für die Analyse wurde
ein faseroptischer Affinitätssensor bzw. ein Durchfluss-Biochip-Scanner
mit integrierter Fluoreszenzdetektion verwendet. An den immobilisierten
Analyten (PCR-Produkten) wurde eine Fluoreszenzoligonukleotidsonde hybridisiert
und anschließend die Dissoziation der Sonde im Fluss verfolgt. Die Diskriminierung
von Wildtyp- und Mutanten-DNA erfolgte durch die kinetische Auswertung
der Dissoziationskurven sowie durch die Analyse der Fluoreszenzintensität.
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Die Versuche am faseroptischen Affinitätssensor zeigten, dass DNA-DNA-Hybride
sowohl von Oligonukleotiden als auch von PCR-Produkten ein typisches Dissoziationsverhalten
aufweisen, wobei fehlgepaarte Hybride eine signifikant schnellere Dissoziation
zeigen als perfekt passende Hybride. Dieser Geschwindigkeitsunterschied
lässt sich durch den Vergleich der jeweiligen kinetischen Geschwindigkeitskonstanten
kD quantitativ erfassen. </p>
<p>Da die Kopplung des Analyten an der Chipoberfläche sowie die Hybridisierungs-
und Dissoziationsparameter essentiell für die Methodenentwicklung war,
wurden die Parameter für ein optimales Spotting und die Immobilisierung
von PCR-Produkten ermittelt. Getestet wurden die affine Kopplung von biotinylierten
PCR-Produkten an Streptavidin-, Avidin- und NeutrAvidin-Oberflächen sowie
die kovalente Bindung von phosphorylierten Amplifikaten mit der EDC/Methylimidazol-Methode.
Die besten Ergebnisse sowohl in Spotform und -homogenität als auch im
Signal/Rausch-Verhältnis wurden an NeutrAvidin-Oberflächen erreicht. </p>
<p>Für die Etablierung der Mikroarray-Genotypisierungsmethode durch kinetische
Analyse nach einem Hybridisierungsexperiment wurden Sondenlänge, Puffersystem,
Spotting-Konzentration des Analyten sowie Temperatur optimiert. Das Analysensystem
erlaubte es, PCR-Produkte mit einer Konzentration von 250 ng/µl in einem
HEPES-EDTA-NaCl-Puffer auf mit NeutrAvidin beschichtete Glasträger zu
spotten. In den anschließenden Hybridisierungs- und Dissoziationsexperimenten
bei 30 °C konnte die Diskriminierung von homocygoter Wildtyp- und homocygoter
Mutanten- sowie heterocygoter DNA am Beispiel von Oligonukleotid-Hybriden
erreicht werden. </p>
<p>In einer Gruppe von 24 homocygoten Patienten wurde ein Polymorphismus
im SULT1A1-Gen analysiert. Sowohl durch kinetische Auswertung als auch
mit der Analyse der Fluoreszenzintensität wurde der Genotyp der Proben
identifiziert. Die Ergebnisse wurden mit dem Referenzverfahren, der Restriktionschnittstellenanalyse
(PCR-RFLP) validiert. Lediglich ein Genotyp wurde falsch bestimmt, die
Genauigkeit lag bei 96%. </p>
<p>In einer Gruppe von 44 Patienten wurde der Genotyp eines SNP in der Adiponectin-Promotor-Region
untersucht. Nach Vergleich der Analysenergebnisse mit denen eines Referenzverfahrens
konnten lediglich 14 der untersuchten Genotypen bestätigt werden. Ursache
für die unzureichende Genauigkeit der Methode war vor allem das schlechte
Signal/Rausch-Verhältnis.</p>
<p> Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das in dieser Arbeit entwickelte
Analysesystem für die Genotypisierung von Einzelpunktmutationen geeignet
ist, homocygote Patientenproben zuverlässig zu analysieren. Prinzipiell
ist das auch bei heterocygoter DNA möglich. Da nach aktuellem Kenntnisstand
eine SNP-Analysemethode an immobilisierten PCR-Produkten noch nicht veröffentlicht
wurde, stellt das hier entwickelte Verfahren eine Alternative zu bisher
bekannten Mikroarray-Verfahren dar. Als besonders vorteilhaft erweist
sich der reverse Ansatz der Methode. </p>
<p>Der hier vorgestellte Ansatz ist eine kostengünstigere und weniger hoch
dimensionierte Lösung für Fragestellungen beispielsweise in der Ernährungswissenschaft,
bei denen meist eine mittlere Anzahl Patienten auf nur einige wenige SNPs
zu untersuchen ist. Wenn es gelingt, durch die Weiterentwicklung der Hardware
bzw. weiterer Optimierung, eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses
und damit die Diskriminierung von heterocygoter DNA zu erreichen, kann
diese Methode zukünftig bei der Analyse von mittelgroßen Patientengruppen
alternativ zu anderen Genotypisierungsmethoden verwendet werden. / The aim of this thesis was the development of a SNP genotyping method
involving PCR products immobilised on microarrays. For the analysis a fibre
optic affinity biosensor and a flow-through biochip scanner were used.
Fluorescent probes were hybridized with the immobilised PCR products. In
order to start the dissociation process the surface was rinsed with buffer
and the fluorescence intensity was measured.
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Two different cases were studied: First, the full-matched DNA hybrid
(wildtyp single strand with complementary wildtype single strand), second
the mis-matched hybrid (wildtype single strand and mutant single strand).
After determinating the reaction rates (kD) as kinetic parameter the kD
values of both cases were compared. The experiments showed a significant
difference in the kD value of the full- and the mis-match hybrids.
Therefore, mutant and wildtype DNA were discriminated by kinetic analysis
of the dissociation process and analysis of the fluorescence intensity.
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To set up the complete analysis process the reaction parameters like
coupling of the PCR products had to be optimised. Both affininty coupled
(streptavidin, neutravidin, avidin - biotin) and covalent methods
(EDC/methylimidazol) were carried out. Best results in spot homogeinity and
spot appearance were obtained with coupling of biotinylated PCR products on
neutravidin coated chip surfaces. Additionally, the length of the probe,
the spotting concentration, the spotting buffer and the reaction
temperature were optimised. In the optimised analysis PCR products (250
µg/µl) were spotted onto neutravidin coated surfaces. The hybridisation
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and dissociation processes were carried out at 30°C. A HEPES-EDTA-NaCl
buffer was used for spotting, diluting of the fluorescent probe and rinsing
the microarray surface. A fluorescent probe was used with 13 nucleotides in
length. The mis- or full-matching base indicating the polymorphism was
located in the center position of the probe.
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The analysis system was tested with the genomic DNA of a group of 24
homocygote individuals with a SNP in the SULT1A1 gene region. The
hybridisation and dissociation processes were carried out and the reaction
rates were determinated. Subsequently after the analysis in the
flow-through biochip scanner the fluorescence intensity of the
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spots were measured. The results showed very good comparability with
results of a PCR-RFLP analysis (one false genotype). Additionally, a group
of 44 heterocygote DNA samples with one SNP in the adiponectin promotor
region were also genotyped. Compared to a reference method only 14
genotypes were correctly determined. This was mostly due to a low
signal-noise-ratio and needs to be further investigated.
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Besides the problem in analysing heterocygote DNA samples the developed
analysis system is very useful for genotyping SNP in homocygote DNA
samples. The successful analysis of heterocygote sample is principally
possible and with further investigations/optimisation, a better analysis
should be possible.
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The most important advantage of the developed method is the reverse
approach of binding PCR products at the surface instead of
oligonucleotides. This allows the parallel genotyping of several
individuals. Other advantages include low costs and medium sized dimensions
in terms of throughput.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:Potsdam/oai:kobv.de-opus-ubp:221 |
| Date | January 2004 |
| Creators | Schwonbeck, Susanne |
| Publisher | Universität Potsdam, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät. Institut für Biochemie und Biologie |
| Source Sets | Potsdam University |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | Text.Thesis.Doctoral |
| Format | application/pdf |
| Rights | http://opus.kobv.de/ubp/doku/urheberrecht.php |
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