La producció de proteïnes homòlogues i heteròlogues a escala industrial requereix sistemes
d’expressió variats i eficients. Els bacteris grampositius, com Streptomyces, poden ser una
alternativa per a la producció de proteïnes recombinants ja que aquestes són produïdes i
secretades al medi. La seqüenciació del genoma d’algunes espècies de Streptomyces i el seu
anàlisi post-genòmic ha permès determinar i caracteritzar la seva maquinària de secreció. Així,
se sap que els precursors de les proteïnes que s’han de secretar són exportats majoritàriament
per una via principal de secreció (via Sec) o bé per una via secundària (via Tat). Aquests
precursors contenen un pèptid senyal de tipus I que permet la seva correcta translocació a través
de la membrana plasmàtica, la seqüència del qual determina per quina de les dues vies es
dirigeix. Un cop translocades, les peptidases senyal de tipus I (SPases) processen la majoria
d’aquestes proteïnes secretades i les alliberen al medi extracel·lular en la seva forma madura.
Estudis previs en la maquinària de secreció han determinat que Streptomyces lividans té
quatre peptidases senyal Sip (SipW, SipX, SipY i SipZ) de les quals, SipY és la que desenvolupa el
paper majoritari. La soca deficient en aquesta proteïna SipY té la capacitat de secreció
notablement afectada però, paradoxalment, és un bon hoste per a la sobreproducció de
proteïnes secretades, ja que presenta una activitat proteàsica considerablement disminuïda.
En aquest treball s’ha estudiat la producció d’agarasa i de lacasa en la soca SipY- (S. lividans
ΔsipY) a escala de bioreactor per avaluar si aquesta soca pot ser considerada com a possible
hoste per a la producció de proteïnes recombinants per la indústria. Aquestes dues proteïnes se
secreten majoritàriament per la via Tat. En el cas de l’enzim agarasa, el gen expressat prové de
S. coelicolor A3(2) i s’ha produït l’enzim en discontinu amb la soca salvatge (S. lividans
TK21pAGAs5) i la soca mutada (S. lividans ΔsipYpAGAs5). La soca S. lividans ΔsipYpAGAs5 ha
presentat una millor producció i s’ha seleccionat el medi més adequat per tal de produir aquesta
proteïna estudiant el seu comportament operant en continu. També s’han estudiat diferents
estratègies en discontinu alimentat, entre les quals la major producció s’ha obtingut amb una
addició de mannitol i evitant que aquesta font de carboni s’esgoti en el medi.
En el cas de la lacasa, s’han construït tres soques en les quals el gen de la pròpia lacasa de S.
lividans és regulat per tres promotors diferents: el promotor propi de la lacasa, el promotor del
gen de resistència a eritromicina i el promotor del gen agarasa de S. coelicolor. La soca en el qual
el gen és regulat pel promotor del gen agarasa (S. lividans ΔsipYpFD-DagA-laccase) ha estat
seleccionada i s’ha estudiat la producció de l’enzim utilitzant mannitol o glucosa com a font de
carboni en discontinu i discontinu alimentat. En l’operació en discontinu alimentat van ser
necessàries dues addicions de glucosa per assolir els mateixos nivells de producció que amb una
addició de mannitol. / Recombinant protein production on industrial scale requires varied and efficient expression
systems. Gram-positive bacteria such as Streptomyces, may be an alternative since proteins are
secreted through the medium. The sequence of the genome of several Streptomyces species
and their post-genomic analysis has allowed to determine and characterize the secretion
machinery. Two secretion pathways are mainly use in Streptomyces: Sec pathway and Tat
pathway. Protein precursors contain type I signal peptide that allows a proper translocation
though membrane and whose sequence determines which pathway must be used in order to
export each protein. During its translocation, type I signal peptidases (SPases) cleave the signal
peptide leading the secretion of the mature protein through the medium. Previous studies on
the secretory machinery have described four signal peptidases in Streptomyces lividans (SipW,
SipX, SipY and Sip Z) and they have postulate SipY as the one which develops the main role in
protein secretion. SipY deficient strain has a secretion ability significantly affected but,
paradoxically, it is a good host for the protein overproduction since it has a considerably reduced
protease activity.
In this work, we have studied the production of agarase and laccase in SipY- strain (S. lividans
ΔsipY) in a bioreactor scale to assess whether this strain can be considered as a host for the
production of recombinant proteins in the industry. These two proteins are mainly secreted by
Tat pathway. Firstly, agarase from S. coelicolor A3(2) was cloned in a multicopy plasmid in S.
lividans wild type strain and SipY- mutant strain (S. lividans TK21pAGAs5 and S. lividans
ΔsipYpAGAs5). Batch cultures have been carried out and S. lividans ΔsipYpAGAs5 of which has
presented better agarase production and it has been selected. Appropriated medium has been
also selected operating in continuous.
Secondly, focusing on laccase production, three strains have been constructed in which the
homologous gene of S. lividans is regulated by three different promoters: its own promoter,
the promoter of erythromycin resistance gene and the S. coelicolor agarase promoter. The
strain in which the laccase gene is regulated by agarase promoter (S. lividans ΔsipYpFD-DagAplaccase)
has been selected and studied in batch and fed-batch mode using mannitol or
glucoses as carbon source. In fed-batch cultures, two glucose addition have been necessary to
achieve the same production as unic mannitol addition.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/285079 |
| Date | 18 November 2014 |
| Creators | Vidal Gabarró, Marcel·la |
| Contributors | López Santín, Josep, Caminal i Saperas, Gloria, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Catalan |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 150 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0079 seconds