El receptor del factor de creixement nerviós TrkA contribueix a la supervivència i a ladiferenciació de diferents poblacions neuronals. Tot i que les principals vies de senyalització imolècules adaptadores activades després de la unió del lligant al receptor estan benestudiades, recentment un creixent nombre de proteïnes que interaccionen amb TrkA hanestat descrites com a nous mecanismes de regulació del receptor. La trans-autofosforilaciódel receptor, a més d'activar les cascades de senyalització rellevants per la diferenciació isupervivència cel·lular, com són les vies de les MAPKs i PI3K-Akt, també indueix un augmenttransitori de la concentració de calci citoplasmàtic. En conseqüència la proteïna sensora deCa2+ calmodulina (CaM) també participa en la senyalització per TrkA. El nostre grup estavainteressat en discernir la relació entre CaM i TrkA, i vàrem descobrir que CaM interaccionadirectament i de manera Ca2+-dependent amb l'extrem carboxi-terminal de TrkA. A partird'aquests resultats ens vàrem plantejar de buscar la posició exacta del domini d'unió acalmodulina en la seqüencia de TrkA. Donat que els programes de predicció no van trobar unaseqüència candidata d'unió a CaM en el domini intracel·lular del TrkA, vàrem centrar-nos en elextrem COOH-terminal del receptor, un domini ric en aminoàcids hidrofòbics en posicionsconservades. Vàrem introduir mutacions en dos aminoàcids del domini candidat, Leu784 iVal790 substituint-los per Ala. Els assajos d'unió van mostrar que els mutants TrkA-L784A iTrkA-L784A-V790A no perdien la unió a CaM, per tant no formaven part del domini d'unió aCaM de TrkA. Tanmateix, vàrem demostrar que aquests aminoàcids hidrofòbics són importantsper a la unió i la regulació de la lligasa d'ubiquitina Nedd4-2. Vàrem observar una fortainteracció dels dos receptors mutants amb Nedd4-2, que es corroborava amb una augmentadaco-localització de les dues proteïnes detectada per immunofluorescència. Com a conseqüèncias'observà una intensa multimonoubiquitinització basal dels receptors mutants mitjançada perNedd4-2. Aquests resultats correlacionen amb un important descens en la quantitat dereceptor a causa d'un direccionament d'aquest cap als endosomes tardans/lisosomes. Totplegat resultava en un increment en la degradació dels receptors mutats. Malgrat la reduccióen la quantitat de receptors de membrana, els receptors TrkA mutats van ser capaçosd'activar vies de senyalització, i fins i tot eren més eficients en promoure l'extensió deneurites que els receptors TrkA normals. Els nostres resultats demostren que la composició del'extrem COOH-terminal de TrkA participa en la regulació de la unió i activitat de Nedd4-2.Així mateix, s'evidencia que la ubiquitinització de TrkA per Nedd4-2 promou el tràficendosomal de TrkA cap als endosomes tardans/lisosomes augmentant d'aquesta manera ladegradació del receptor. Per altra banda, s'observa que la multimonoubiquitinització de TrkAno interfereix en l'activació de les vies de senyalització, tanmateix potencia la senyalització delreceptor conduent a la diferenciació cel·lular. / El receptor del factor de crecimiento nervioso TrkA contribuye a la supervivencia ydiferenciación de varias poblaciones neuronales. A pesar del buen conocimiento de lasprincipales vías de señalización y las proteínas adaptadoras activadas después de la unión delligando al receptor, últimamente se ha descrito un número creciente de proteínas queinteraccionan con el receptor participando en su regulación. La trans-autofosforilación delreceptor, adicionalmente a la activación de vías de señalización relevantes para ladiferenciación y la supervivencia celular, como son las vías de las MAPKs y PI3K-Akt, tambiénconlleva un aumento transitorio del calcio citoplasmático. En consecuencia la proteína sensorade calcio calmodulina (CaM) también participa en la señalización por TrkA. Nuestro grupo teníainterés en estudiar la relación entre CaM y TrkA y descubrió que la CaM interacciona de formadirecta y calcio dependiente con el extremo COOH-terminal del receptor TrkA. A partir deestos resultados nos plantemaos buscar la posición exacta del sitio de unión a calmodulinadentro de la secuencia de TrkA. Puesto que los programas de predicción no encontraronninguna secuencia candidata de unión a calmodulina en el dominio intracelular de TrkA, noscentramos en el extremo COOH-terminal, dominio rico en ácidos hidrofóbicos en posicionesconservadas. Introducimos mutaciones puntuales en el sitio candidato de unión a CaMcambiando la L784 y la V790 por Ala. Los ensayos de unión a CaM realizados mostraron quelos mutantes TrkA-L784A y TrkAL784A-V790A no perdían la unión a CaM, por lo tanto noformaban parte del dominio de unión a CaM de TrkA. Sin embargo, hemos demostrado queestos aminoácidos son importantes para la unión y la regulación de la ligasa de ubiquitinaNedd4-2. . Observamos una mayor interacción de los dos mutantes del extremo COOHterminalcon Nedd4-2, resultado que era corroborado por una mayor colocalización de las dosproteínas detectada por immunofluorescencia. Como consecuencia observamos una intensamultimonoubiquitinización basal de los receptores mutados mediada por Nedd4-2. Estosresultados correlacionan con un importante descenso de la cantidad de receptor a causa deun direccionamiento de este hacia los endosomas tardíos/lisosomas. Todo ello resultaba en unincremento en la degradación de los receptors mutados. A pesar de la reducción en la cantidadde receptor en membrana, los mutantes de TrkA mostraron ser capaces de activar las vías deseñalización e incluso ser más eficientes promoviendo el crecimiento de neuritas comparandocon el receptor normal. Estos resultados demuestran que la composición del extremo COOHterminalde TrkA regula la unión y la actividad de la ligasa de ubiquitina Nedd4-2. Además, laubiquitinización de TrkA mediada por Nedd4-2 promueve el direccionamiento de los receptoresmutados hacia los endosomas tardíos/lysosomas dando lugar a una mayor degradación delreceptor. Por otro lado, se observa que la multimonoubiquitinización de TrkA no interfiere conla activación de las vías de señalización, sino más bien potencia la señalización del receptorque conduce a la diferenciación celular. / The nerve growth factor receptor TrkA contributes to the survival anddifferentiation of several neuronal populations. Although main signaling pathwaysand adaptor molecules activated after ligand binding to the receptor are well studied,recently a growing number of TrkA interacting proteins have been described as novelmechanisms of receptor regulation. Receptor trans-autophosphorylation, additionallyto activating signaling cascades relevant for cell differentiation and survival, such asMAPKs and PI3K-Akt, also induces a transient increase in intracellular calciumconcentration. Therefore, the Ca2+ sensor calmodulin (CaM) also participates in TrkAsignaling. Our group was interested in elucidating the relationship between CaM andTrkA, and discovered that CaM interacts directly with the C-terminal tail of TrkA in aCa2+ dependent manner. Consequently, we sought to find the exact position of thecalmodulin binding site on TrkA sequence. Since available prediction software wasunable to find a putative CaM binding site in TrkA intracellular domain, we focusedon the C-terminal tail, a domain rich in hydrophobic amino acids in conservedpositions. We introduced point mutations on Leu784 and Val790 by switching themto Ala, located on our predicted CaM binding site. However, TrkA-L784A and TrkAL784A/V790A mutants did not lose CaM binding, therefore they were not involved onCaM binding. Nonetheless, we demonstrated that these hydrophobic aminoacids areimportant for the binding and regulation of Nedd4-2 Ub ligase. We observed astronger interaction of both C-terminal mutant receptors with Nedd4-2, corroboratedwith a higher colocalization of both proteins by immunofluorescence. Consequently,we observed an enhanced basal multimonoubiquitination of mutant receptors byNedd4-2. These results correlated with a decrease in TrkA abundance due to a fasterlate endosome/lysosome targeting, leading to a higher degradation rate of mutantreceptors. Despite the reduction in the amount of membrane receptor caused by theC-terminal changes, TrkA mutants were able to activate signaling cascades and wereeven more efficient in promoting neurite outgrowth than the wild-type receptor. Ourresults demonstrate that the C-terminal tail conformation of TrkA regulates Nedd4-2binding and activity. Moreover, TrkA ubiquitination by Nedd4-2 promotes TrkAendosomal trafficking to late endosome/lysosome leading to receptor degradation. Inaddition, TrkA multimonoubiquitination does not interfere with the activation ofsignaling cascades, but rather potentiates receptor signaling leading todifferentiation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UDL/oai:www.tdx.cat:10803/8106 |
| Date | 17 September 2010 |
| Creators | Maya Vladkova, Georgieva |
| Contributors | Llovera i Tomàs, Marta, Universitat de Lleida. Departament de Ciències Mèdiques Bàsiques |
| Publisher | Universitat de Lleida |
| Source Sets | Universitat de Lleida |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Page generated in 0.0036 seconds