Este trabajo abarca distintos aspectos de la metodología de la transferenciagénica en lubina, tanto in vitro como in vivo. Por una parte, se ha centrado en el estudioy evaluación de la transferencia génica somática como posible sustitución a latransgénesis estable en distintas aplicaciones. Por otra parte, se ha evaluado el sistemade regulación por tetraciclina para la regulación exógena de genes en peces. Por último,se ha probado que una línea celular de lubina puede utilizarse como sistema deexpresión de genes exógenos.Por primera vez se demuestra que la inyección de DNA plasmídico es eficientepara transferir genes exógenos a músculo de lubina. Los factores que favorecen laexpresión son, dosis altas de plásmido, el uso de un promotor adecuado, y un estadometabolicamente activo del músculo. La expresión que se obtiene es transitoria,alcanzándose el máximo cinco días después de la inyección. Una limitación de estatécnica es la incapacidad de reproducir en los distintos individuos inyectados, lamanera exacta en que la aguja de inyección entra en el paquete muscular, lo queorigina una gran variabilidad en cuanto a la toma de DNA por parte de las células, ypor tanto en el nivel de expresión del transgen. Esto se puede mejorar aumentando elnúmero de animales inyectados para disminuir así el error debido a la técnica, o usandouna segunda construcción para normalizar la transfección.La técnica de inyección de DNA en músculo se ha ensayado como método devacunación en peces. Sin embargo, ésta es la primera vez, que se prueba esta técnica enpeces para secretar una hormona en sangre. Como gen a inyectar se ha diseñado yconstruido un gen híbrido que codifica una hormona gonadotropa de cadena única delubina. Tras su inyección en músculo de lubina se pudo detectar la proteína en plasma.Para sistemas de origen piscícola, no se dispone hasta el momento de un métodoque permita controlar la expresión de genes exógenos de manera fiable. Por primeravez, hemos probado la utilidad del sistema de regulación por tetraciclina para estamisión. Tras valorar diferentes versiones del sistema en células de pez in vitro y enmúsculo in vivo, podemos concluir que la opción más eficiente es el uso deltransactivador tTA bajo el control de un promotor estable.Al igual que en células de mamíferos, hemos comprobado que las células de peztambién presentan dificultades para mantener el sistema de regulación por tetraciclinade una manera funcional; como resultado, encontrar clones con un grado de regulaciónóptimo y un nivel bajo de expresión basal es difícil. Sin embargo, el uso de unaestrategia basada en el uso del plásmido nuevo pTet-luc+-pur/GFP facilita esta tarea, ypermite obtener un alto porcentaje de clones regulables.A lo largo de este trabajo se han comparado los promotores CMV, de origenviral, y el promotor de la actina ß de carpa, para dirigir la expresión de distintos genestanto en las líneas celulares EPC y SBL, como en músculo de lubina in vivo. Losresultados nos permite concluir que el promotor de la actina ß de carpa, es más débil encuanto al nivel de expresión génica que logra promover, y menos estable a la hora demantenerse en una línea celular que el promotor CMV.Por último, los resultados obtenidos con la línea celular SBL permiten señalar aesta línea como un sistema de lubina apto para la expresión de genes exógenos. Estascélulas son capaces de secretar los productos de los genes introducidos, con lo quepodrían ser utilizadas para la producción de proteínas recombinantes. / This work focuses on different aspects of the gene transfer methodology in sea bass.On one hand, the use of the somatic gene transfer has been evaluated as an alternative to theuse of stable transgenesis in different applications. Somatic gene transfer has been used asmethod of delivery of a recombinant single-chain gonadotropin into the blood stream in seabass. On the other hand, we have evaluated the use of the tetracycline regulated system tocontrol exogenous gene expression in fish. The results showed that the best choice was the useof the rtTA transactivator under the control of a stable promoter. Finally, a sea bass cell linehas proven to be an efficient system for the expression of exogenous gene.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UV/oai:www.tdx.cat:10803/9902 |
| Date | 07 November 2005 |
| Creators | Muñoz Forcada, Iciar |
| Contributors | Carrillo Estévez, Manuel, Gómez Peris, Ana Mª, Universitat de València. Departament de Fisiologia |
| Publisher | Universitat de València |
| Source Sets | Universitat de València |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
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