Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Insulina y su receptor (RI) regulan el metabolismo de ácidos grasos y
carbohidratos en el corazón. La activación de este receptor por su ligando
endógeno desencadena una serie de eventos reguladores de la homeostasis
energética del cardiomiocito. Se desconoce el efecto de insulina sobre los niveles
de [Ca2+]i, un importante regulador de la contracción y de la transducción de
señales en el cardiomiocito. Nuestro objetivo consistió en investigar el mecanismo
mediante el cual insulina regula los niveles de [Ca2+]i en cultivos primarios de
cardiomiocitos neonatos.
Los resultados de inmunofluorescencia y microscopía confocal mostraron
que el RI esta presente en la membrana plasmática, citoplasma y región
perinuclear en cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas, mientras
que en cardiomiocitos adultos sólo se localizó en la membrana plasmática y sus
inmediaciones. Los análisis Western blot revelaron que el RI está presente en
extractos totales de cardiomiocitos y que al estimularlos con insulina 1 nM se
activó la proteína kinasa ERK, un blanco río abajo conocido para el RI. Usando
fluo-3AM y microscopía confocal se estableció que insulina aumentó en forma
rápida (tiempo máximo: 1s) y transitoria (28 ± 6 seg) los niveles [Ca2+]i, alcanzando
una respuesta máxima de 214 ± 31% [(ΔF/F)*100] (n=10) y dependiente de la
concentración (0.1-1000 nM). Esta señal fue completamente bloqueada por
genisteina (inhibidor inespecífico de tirosinas kinasas). Nifedipino (inhibidor del
canal Ca2+
VLtype) bloqueó la señal rápida de Ca2+, dejando en evidencia una
segunda señal mas lenta y de menor intensidad. Por otro lado, rianodina (inhibidor del canal de Ca2+ RyR) produjo un efecto similar al de nifedipino, sugiriendo una
entrada de Ca2+ desde el espacio extracelular. La inhibición de PI3-K (LY294002),
de PLC (U-73122) y la expresión adenoviral de un péptido secuestrador de
subunidades βγ de proteína G heterotrimérica (Ad-βARKct), modificaron la cinética
de la señal producida por insulina 1nM, registrándose señales rápidas de 1 seg de
duración para cualquiera de estas condiciones. La inhibición de la proteína Gi/o con
toxina pertussis solo modificó parcialmente el perfil cinético de la señal. De esta
forma, nuestros resultados sugieren que aumenta los niveles de [Ca2+]i, a través
de un mecanismo que involucra, en una primera etapa a la vía de transducción:
IR-Ca2+
VLtype-RyR-Ca2+, y luego a la vía: IR-Gβγ-PI3K-PLC-IP3-Ca2+ / Insulin and its receptor (IR) regulate lipid and carbohydrate metabolism in
the cardiac tissue. IR activation triggers a series of regulatory signaling events for
cardiomyocyte energy homeostasis. Whether insulin changes intracellular calcium
levels, an important second messeger for myocardial contraction remains
unknown. Our aim was to investigate the mechanism by which insulin could
regulate intracellular calcium levels in cultured neonatal rat cardiomyocytes.
Inmunofluorescence and confocal microscopy studies showed that the IR
was detected in cytoplasmic membrane, cytoplasm and perinuclear region in
primary cultured neonatal cardiomyocytes while in cultured adult rat
cardiomyocytes was only located on or nearby the cytoplasmic membrane.
Western blots analisis also revealed the presence of IR and the activation of ERK,
a target in IR signaling molecule downstream of the IR, in total extract obtained
from cardiomyocyte treated with insulin. Using Fluo3-AM and confocal microscopy,
we detected that insulin increases fast (maximum after 1 sec) and transient (28 ± 6
sec) intracellular Ca2+ levels, reaching a maximum of 214 ± 1% [(ΔF/F)*100]
(n=10). This effect was also concentration-dependent (0.1–1000 nM). This signal
was completely blocked by genistein (a general tyrosine kinase inhibitor).
Nifedipine (a Ca2+
V L-type channel inhibitor) blocked the first and fast signal of
[Ca2+]i, revealing a more slower and smaller second component of the signal.
Ryanodine (RyR channel Ca2+ blocker) produced an similar effect than nifedipine,
suggesting a Ca2+ entry from the extracellular space. The inhibition of PI3K by LY-
294002, phosphoplipase C by U-73122 and the G protein βγ subunits by adenoviral expresion of a sequestering peptide (Adβarkct), modified the time-course of the
insulin-induced signal, detecting fast increases in calcium levels for any of the
studied experimental conditions. The inhibition of the αi/o subunit of G protein with
pertussis toxin only modified partially the calcium kinetic pattern. Our results
collectivelly suggest that insulin increases the [Ca2+]i levels by two signaling
pathway, a first one involving the IR-Ca2+
VLtype-RyR-Ca2+ and a second
conformed by IR-Gβγ-PI3K-PLC-IP3-Ca2+
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/105530 |
| Date | January 2007 |
| Creators | Contreras Ferrat, Ariel Eduardo |
| Contributors | Lavandero González, Sergio, Jaimovich Pérez, Enrique, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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