Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar
al grado de Doctor en Farmacología / La hipertrofia cardíaca es una respuesta adaptativa desencadenada por una mayor
demanda de trabajo contráctil por parte del cardiomiocito, su desarrollo es el resultado
de múltiples factores, existiendo una hipertrofia cardíaca de tipo fisiológica, reversible,
sin signos histológicos de fibrosis, generada por factores de crecimiento como el factor
de crecimiento análogo a insulina tipo 1 (IGF-1) y otra de tipo patológico, irreversible,
cuya progresión genera insuficiencia cardíaca y cardiomiopatía dilatada, asociada a la
acción de agonistas de receptores acoplados a proteína G como norepinefrina (NE), entre
otros. Un aspecto importante a considerar es el metabolismo energético del corazón y su
participación en el proceso hipertrófico, puesto que es uno de los órganos con mayor
tasa de consumo de ATP y una disminución en la disponibilidad energética se traduce en
alteraciones de la actividad contráctil y en el desarrollo de distintas patologías cardíacas.
La mitocondria es el organelo responsable de la generación de energía en la célula, en
el cardiomiocito se encuentran ubicadas entre las miofibrillas y ocupan sobre el 50% del
volumen citoplasmático en el músculo cardíaco. Actualmente se reconoce la existencia de
un retículo mitocondrial, donde estos organelos forman verdaderos “cables energéticos”
cuya morfología y función dependen del equilibrio entre los procesos de fisión y fusión
mitocondrial. Diversas proteínas, entre ellas OPA-1 y Mfn1/2 se relacionan con fusión
mitocondrial mientras que Drp-1 y Fis-1 se asocian al proceso inverso.
Tomando en cuenta la relación entre metabolismo e hipertrofia cardíaca, resulta
evidente la importancia que adquieren los procesos de dinámica mitocondrial al regular la
función de este organelo. Hasta la fecha se desconoce qué tipo de proceso de dinámica
mitocondrial predomina en hipertrofia cardíaca, ni en qué forma la fusión/fisión de la
mitocondria afecta el desarrollo del proceso hipertrófico en el cardiomiocito. Por esta
razón, el objetivo principal del presente trabajo consistió en determinar si los estímulos
prohipertróficos IGF-1 o NE, alteran la morfología y actividad mitocondrial. Para este fin,
cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas se trataron con IGF-1 (10 nM)
o NE (10 M) entre 0 - 48 h. La red mitocondrial se visualizó mediante microscopía
confocal y tinción con mitotracker Green. Los resultados muestran que desde las 24 h, NE produjo fisión de la red mitocondrial, identificada por un incremento en el porcentaje de
células con fragmentación mitocondrial (+26 %, p<0,05 y +39 %, p<0,001), en el número
relativo de mitocondrias por célula (+42 %, p<0,005 y +65 %, p<0,001) y disminución
en el volumen mitocondrial promedio (-24 %, p<0,005 y -47 %, p<0,001, para las 24
y 48 h, respectivamente. Además, luego de los cambios morfológicos se observó una
disminución del potencial de membrana mitocondrial (-23 %, p<0,05), del contenido
intracelular de ATP (-27 %, p<0,05) y de la velocidad de consumo de oxígeno (-24 %,
p<0,05), después de 48 h de exposición a NE. No se observaron cambios morfológicos
ni metabólicos en la red mitocondrial de cardiomiocitos tratados con IGF-1. Igualmente
se observó que la fisión mitocondrial inducida por NE se asoció con un incremento en la
migración de Drp-1 a mitocondria, evaluado a través de un incremento en los niveles de
Drp-1 en fracción mitocondrial y aumento en la colocalización entre Drp-1 y Fis-1.
Calcineurina es una de las proteínas transduccionales de mayor relevancia en la
respuesta hipertrófica inducida por NE, describiéndose que participa en la modulación
de la dinámica mitocondrial mediante desfosforilación de Drp-1, incrementando su
actividad. Para evaluar su participación, cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas
neonatas se transducieron con un adenovirus que expresa la subunidad catalítica de
calcineurina constitutivamente activa (AdCN) o con uno que codifica un péptido inhibitorio
para calcineurina (CAIN), observándose que su inhibición redujo significativamente los
cambios morfológicos en la red mitocondrial inducidos por NE y que su sobreexpresión es
suficiente para producir fisión mitocondrial. Además, el uso de herramientas adenovirales,
también permitió determinar que una disminución en los niveles de Mfn2 produce fisión
mitocondrial e induce la respuesta hipertrófica en el cardiomiocito, determinada como
un incremento en el área celular, la sarcomerización y la reexpresión de biomarcadores
asociados al proceso, mientras que la disminución en la actividad de Drp-1 fusiona la red
mitocondrial y previene la hipertrofia cardíaca en los cardiomiocitos tratados con ambos
estímulos.
En base a estos resultados, se puede concluir que durante el desarrollo del proceso
hipertrófico patológico del cardiomiocito se produce fragmentación de la red mitocondrial,
a través de un mecanismo que involucra el incremento en la migración de Drp-1 amembrana mitocondrial y la participación de la fosfatasa calcineurina, todo esto asociado
a una disminución en diversos parámetros metabólicos. Por otro lado, la modulación
en los niveles o actividad de proteínas asociadas a los procesos de fusión y fisión
mitocondrial, modificó significativamente el desarrollo del proceso hipertrófico, por lo que
colectivamente, estos resultados revelan la importancia de los procesos de dinámica
mitocondrial en el desarrollo de hipertrofia cardíaca. / Cardiac hypertrophy is an adaptive response induced by an increased contractile
work. Physiological cardiac hypertrophy is reversible, without histological signs of fibrosis,
generated by growth factors such as insulin like growth factor 1 (IGF-1). In contrast,
pathological cardiac hypertrophy is irreversible, progress to heart failure and dilated
cardiomyopathy and it has been associated with the action of G protein-coupled receptors
agonists such as norepinephrine. An important aspect to consider is the heart’s energy
metabolism and its role in the hypertrophic process, since myocardial tissue is one of
the organs with the highest rate of ATP consumption. A decrease in energy availability
results in detrimental changes in contractile activity and the development of distinct
cardiac diseases. Mitochondria have a key role in energy generation in the cardiomyocyte
are located between the myofibrils and occupy over 50% of cytoplasmic volume. The
existence of a mitochondrial reticulum is recognized now and these organelles are true
"power-transmitting cables" whose morphology and function depend on the balance
between mitochondrial fission and fusion. Several proteins like OPA-1 and Mfn1/2
have been linked to mitochondrial fusion while Drp-1 and Fis-1 are associated with
mitochondrial fission.
Taking into account the relationship between metabolism and cardiac hypertrophy,
the role of mitochondrial dynamics in the developrment of hypertrophyc growth must be
relevant. However, the mitochondrial morphology in the hypertrophic cardiomyocyte, or
how the mitochondrial fusion/fission events affect the development of the cardiomyocyte
hypertrophic process is unknown. For this reason, our main objective was to investigate
whether IGF-1 or NE stimulation produces changes in morphology and mitochondrial
activity. For this goal, primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes were treated with
IGF-1 (10 nM) or NE (10 M) for 0 - 48 h. The mitochondrial network was visualized
by confocal microscopy and Mitotracker Green staining. The results show that NE
triggered mitochondrial fission after 24 hours of exposure, identified by an increase in the percentage of cells with mitochondrial fragmentation (+26 %, p <0.05 and +39 %,
p <0.001), increase in the relative number of mitochondria per cell (+42 %, p <0.005
and +65 %, p <0.001) and decrease in the average mitochondrial volume (-24 %, p
<0.005 and -47 %, p < 0.001, for the 24 and 48 h respectively). In addition to these,
morphological changes, decreases in mitochondrial membrane potential (-23 %, p <0.05),
intracellular ATP content (-27 %, p <0.05) and oxygen consumption rate (-24 %, p <0.05)
were also observed after 48 h of exposure to NE. No morphological or metabolic changes
in the mitochondrial network were detected in cardiomyocytes treated with IGF-1. NEinduced
mitochondrial fission was associated with an increase in the migration of Drp-1
to mitochondria, evaluated by increase in levels of Drp-1 in mitochondrial fraction and by
Drp-1 and Fis-1 colocalization.
Calcineurin is one of the most important signaling molecules in the hypertrophic
response induced by NE. This phosphatase is also involved in the modulation of
mitochondrial dynamics by dephosphorylation of Drp-1, increasing its activity. To evaluate
its role, culture neonatal rat cardiomyocytes were transduced with an adenovirus
expressesing the calcineurin catalytic subunit constitutively active (AdCN) an inhibitory
peptide (CAIN). Inhibition of calcineurin significantly decreased morphological changes
in the mitochondrial network triggered by NE and AdCN overexpression being sufficient
to cause mitochondrial fission. Using other adenoviral tools, we show that a decrease in
Mfn2 levels causes mitochondrial fission, and induces the cardiomyocyte hypertrophic
response, determined by increases in cell area, sarcomerización and biomarkers
associated with hypertrophic response. The decrease in Drp-1 activity, stimulated
mitochondrial fusion and prevented cardiac hypertrophy induced by NE and IGF-1.
Collectively our results suggest, that mitochondrial network is fragmented during the
development of pathological cardiomyocyte hypertrophy, through a mechanism involving
the migration of Drp1 to the mitochondria and the phosphatase calcineurin activation,
associated with decreases in several metabolic parameters. In addition, the modulation in
the activity of proteins associated with mitochondrial fusion/fission, produced significant
changes in the development of hypertrophy. Collectively these results demonstrate the
importance of mitochondrial dynamics in the development of cardiac hypertrophy. / CONICYT; FONDAP; FONDECYT; MECESUP
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/112010 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Pennanen Saavedra, Christian |
| Contributors | Lavandero González, Sergio, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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