Tesis presentada a la Universidad de Chile
para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica
área de especialización en Bioquímica Clínica y
Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / Pneumocystis jirovecii es un microorganismo fúngico capaz de infectar el tracto respiratorio de individuos con
algún tipo de inmunocompromiso, y causarles neumonía por Pneumocystis (PCP). Investigaciones más recientes han
comprobado que P. jirovecii también se puede hallar en el tracto respiratorio de personas aparentemente
inmunocompetentes, sobre todo en lactantes menores de un año de edad, en quienes se denomina “infección
primaria”. Aquellos hospederos en quienes se ha detectado el microorganismo en muestras respiratorias, pero que
no presentan sintomatología de PCP, se consideran “colonizados” por Pneumocystis. A pesar de los avances en la
investigación básica, clínica y epidemiológica de Pneumocystis, no se ha comprobado si el hongo contribuye a la
morbilidad de enfermedades respiratorias que a veces presentan pacientes adultos colonizados o lactantes con
infección primaria.
En vista de lo anterior, y considerando el inconveniente que Pneumocystis no es un hongo cultivable hasta el
momento, ha surgido la necesidad de desarrollar nuevos métodos de detección y cuantificación de Pneumocystis que
permitan estudiar más a fondo su relevancia clínica y epidemiológica, sobre todo en los grupos de pacientes
inmunocompetentes antes mencionados. A este respecto, durante la última década se ha aplicado la técnica de
Reacción en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real (q-PCR [quantitative]) para la detección de Pneumocystis, la
cual permite cuantificar carga de microorganismo en muestras biológicas, incluso cargas bajísimas que comúnmente
no son detectadas por los métodos convencionales. Pero, además de esto, q-PCR permite comparar carga de P.
jirovecii entre muestras distintas procedentes del mismo o de distintos pacientes, si se realiza el procedimiento de
cuantificación relativa. Esto consiste en normalizar la carga absoluta de microorganismo con la cantidad de DNA
humano hallado en la misma muestra, de modo que el cociente resultante es la carga relativa.
Teniendo estos antecedentes, se montó y estandarizó el método de q-PCR para cuantificar P. jirovecii en
pacientes colonizados, tanto adultos como lactantes de diversas edades, mediante el análisis de muestras invasivas
(tejido pulmonar) y no invasivas (aspirado nasofaríngeo, gargarismo e hisopado nasofaríngeo). Se escogió como gen
blanco a MSG, un gen multicopia que codifica para la principal glicoproteína de superficie de Pneumocystis.
La cuantificación relativa de P. jirovecii mostró que hay cargas significativamente distintas del
microorganismo entre ciertos grupos etarios de lactantes colonizados fallecidos por Síndrome de Muerte Súbita
(SMS). En otros grupos de pacientes colonizados (adultos y lactantes sanos) no se observaron diferencias
significativas de carga relativa de P. jirovecii entre distintas edades. Se evidenció en la mayoría de los grupos de
pacientes que la cuantificación relativa presenta un patrón de cargas distinto para cada rango de edad, respecto al
patrón obtenido de la cuantificación absoluta. Además, se investigó cuánto afecta la naturaleza de las muestras en la
precisión de los resultados. En el caso de las muestras que no son homogéneas, como secreciones respiratorias, se
obtuvieron cantidades muy variables de DNA humano, independientemente del tamaño de la muestra, lo cual
produjo resultados con mayor variabilidad respecto a los obtenidos para muestras más homogéneas, como tejido
pulmonar. En conclusión, este trabajo demuestra la importancia de utilizar resultados expresados como cuantificación
relativa, que a diferencia de la absoluta, permite comparar carga de Pneumocystis entre distintas muestras, tras
haber eliminado ciertos factores que inducen a obtener conclusiones distorsionadas. Además se evidenció la
necesidad de escoger el tipo de muestra más apropiado para obtener resultados más confiables y precisos, al menos
para el área de investigación.
Esta investigación contribuye a validar una valiosa herramienta de detección que permite comparar carga de
Pneumocystis entre distintas muestras. Su alta sensibilidad hace posible su aplicación incluso en muestras de
pacientes colonizados por Pneumocystis, cuyas cargas de microorganismo generalmente son demasiado bajas e
indetectables por otros métodos. El contar con esta nueva herramienta en nuestro país, nos permitirá investigar más
a fondo la trascendencia clínica de P. jirovecii en la salud de pacientes colonizados y lactantes con infección primaria,
con o sin enfermedades respiratorias. Así, este trabajo de tesis aporta un respaldo científico a la nueva aplicación de
comparar muestras, utilizando el método más avanzado de diagnóstico molecular de Pneumocystis. / Pneumocystis jirovecii is a fungal microorganism that infects the respiratory tract of immunocompromised
patients and it may cause Pneumocystis pneumonia (PCP). Recent research has demonstrated that P. jirovecii can also
be found in the respiratory tract of apparently immunocompetent patients, especially in infants younger than one
year of age; in this case it is called “primary infection”. Those hosts that show this microorganism in their respiratory
samples, but who have no PCP symptoms, are known as “Pneumocystis colonized”. Despite of the recent advances in
basic, clinical and epidemiologic investigation of Pneumocystis, there is no demonstration whether this fungus affects
morbidity of respiratory diseases, which are sometimes present in colonized adult patients or infants with primary
infection.
In view of this, and considering the inconvenience that, to date, Pneumocystis cannot be cultured, it is
necessary to develop new methods to detect and to quantify Pneumocystis in order to study its clinical and
epidemiological relevance more deeply, especially in the immunocompetent patients mentioned before. On that
score, during the last decade, the technology of Real Time Polymerase Chain Reaction (q-PCR [quantitative]) has been
applied for the detection of Pneumocystis. This technology allows to quantify load of microorganism in biological
samples, even in very low loads which cannot be commonly detected by conventional methods. In addition to this, q-
PCR allows the comparison of P. jirovecii loads among different samples taken from the same or different patients, if
relative quantification is calculated. In procedure, the absolute load of microorganisms is normalized with the amount
of human DNA found in the same sample, so the result is the relative load.
With this information, we established and standarized a q-PCR method in order to quantify P. jirovecii in
colonized patients, both adults and infants at several ages, through the analysis of invasive (pulmonary tissue) and
non invasive samples (nasopharyngeal aspirate, oral wash and nasopharyngeal swab). MSG was chosen as target
gene, this is a multicopy gene which codes for the Major Surface Glycoprotein of Pneumocystis.
The relative quantification of P. jirovecii showed significantly different loads of microorganism between
several age groups of colonized infants who had died of Sudden Infant Death Syndrome (SIDS). Within others
colonized patient groups ―healthy adults and infants― no significantly differences were observed in relative load of
P. jirovecii between different ages. In most patient groups, it was apparent that relative quantification shows a
different load tendency for each age range, compared with the tendency obtained from absolute quantification. In
addition, we investigated the influence of sample composition on the precision of the results. In case of non
homogeneous samples, such as respiratory samples, variable quantities of DNA were obtained, independent of the
sample size. This produced more variability of results, with regard to those obtained from homogeneous samples,
such as pulmonary tissue.
In conclusion, this work demonstrates the relevance of using results expressed as relative quantification,
which, unlike absolute quantification, allows the comparison of Pneumocystis load between different samples, by eliminating some factors which drive to wrong conclusions. Furthermore, the need of choosing the best sample type
in order to obtain results more reliable and precise, at least for research purpose, was demonstrated.
This research work contributes to the validation of a useful detection tool, which allows comparing
Pneumocystis load between different samples. Its high sensitivity makes it possible to use this technology even in
Pneumocystis colonized patients, in which loads of microorganism are generally too low to be detected by other
methods. To have this novel tool in our country, will allow us to investigate in depth the clinical relevance of P.
jirovecii in health of colonized patients and infants with primary infection ―with or without respiratory diseases.
Therefore, this thesis work provides a scientific support to the novel application of comparing samples, using the
most advanced, molecular diagnostic method for Pneumocystis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/112091 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Astorga Saavedra, Jaime Felipe |
| Contributors | Vargas Munita, Sergio, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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