Doctor en Bioquímica / La calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT), una chaperona pleiotrópica de
47 kDa, se transloca desde el retículo endoplásmico (RE) a la zona de emergencia
flagelar, donde actúa como un factor de virulencia principal, además de sus roles
funcionales intracelulares. La TcCRT extracelular media la infectividad del parásito en
virtud de su capacidad para interactuar con los componentes del complemento C1 y
MBL. La inhibición de las vías del complemento clásica y de las lectinas también son
consecuencias de estas interacciones. No se ha reportado respecto a la localización y
funciones de TcCRT una vez que el parásito se encuentra en el interior de la célula
hospedera. Aquí proponemos que, durante la infección por T. cruzi, y mediante el uso
de anticuerpos específicos, es posible detectar TcCRT, una vez que el parásito se
encuentra el interior de la célula hospedera de mamífero. También proponemos que la
expresión de TcCRT en la célula hospedera se correlaciona inversamente con la
expresión de antígenos MHC-I. Al abordar experimentalmente estos temas queremos
contribuir al conocimiento de los términos moleculares que regulan la interacción células
hospederas-T.cruzi, centrándose en el papel de TcCRT en particular, dentro de la célula
hospedera infectada. Para alcanzar este objetivo apuntamos a la validación de la
especificidad de los anticuerpos para ser utilizados como sondas detectoras de TcCRT,
con ello identificar TcCRT interior de los macrófagos murinos infectados y, por último,
evaluar las variaciones en la superficie de las moléculas de MHC- I en los macrófagos
murinos infectados. Por lo tanto, específica y topográficamente se monitoreó la
presencia de TcCRT en los parásitos que infectan a una línea celular de macrófagos
murinos, en comparación con tripomastigotes libres y epimastigotes no infecciosos.
Para ello, se probaron tres anticuerpos diferentes como sondas detectoras para
procedimientos inmunocitoquímicos. Anticuerpos anti-TcCRT policlonales y
monoclonales se validaron como sondas detectoras, ya que mostraron poca o nula
reactividad cruzada. En inmunocitoquímica, el anticuerpo policlonal de conejo, y los
anticuerpos monoclonales murinos anti-TcCRT, detectan TcCRT con diferentes
sensibilidades y especificidades, cuando son revelados con inmunosondas conjugadas
con oro coloidal, seguido por microscopía electrónica de transmisión. Con los
anticuerpos policlonales de conejo, se observaron partículas de CRT, tanto en parásitos
libres como en aquellos que se encuentran dentro del interior de células hospederas
infectadas, principalmente en el núcleo y kinetoplasto del parásito. Con un anticuerpo
monoclonal murino anti-TcCRT, y el uso de partículas de oro de tamaño más grande, se obtuvo una mejora drástica en la sensibilidad y especificidad para la detección TcCRT.
Se detectaron moléculas de TcCRT principalmente en el kinetoplasto del tripomastigote.
Proponemos que este organelo puede representar una escala para TcCRT, generada
en el RE, previo a su translocación a la zona de emergencia flagelar. Esta movilización
puede estar influenciada por las nuevas condiciones ambientales con las que el parásito
se encuentra en el interior de la célula hospedera. Queda por determinar las
consecuencias funcionales de la presencia acumulada de TcCRT en el kinetoplasto. La
posibilidad de que TcCRT regule la transcripción en el ADN del kinetoplasto, según lo
propuesto anteriormente para la CRT de mamífero en el núcleo, podría ser considerada,
aunque la organización de ADN en el kinetoplasto es diferente. Además, TcCRT podría
regular vías de transducción de señales dependientes de Ca+2. Finalmente, por
mecanismos desconocidos, la infección por T. cruzi disminuye el número de células
positivas MHC de clase I, tan temprano como 2 horas después de la infección. Queda
por determinar si TcCRT accede al RE de la célula huésped e interfiere en el proceso de
plegamiento de moléculas MHC clase I / Trypanosoma cruzi calreticulin (TcCRT), a 47 kDa pleiotropic chaperone,
besides its intracellular functional roles, is translocated from the endoplasmic
reticulum (ER) to the area of flagellum emergence where it acts as a main
virulence factor. Extracellular TcCRT mediates parasite infectivity by virtue of its
capacity to interact with complement components C1 and MBL. Both inhibitions of the
classical and lectin complement pathways are also consequences of these
interactions. The localization and functions of TcCRT once the parasite is inside the
host cell has not been reported. Herein we hypothesize that, during T. cruzi infection,
and using specific antibodies, it is possible to detect TcCRT, once the parasite is
inside the mammalian host cell. We also propose that TcCRT expression in the host
cell inversely correlates with the MHC-I antigen expression. By experimentally
addressing these issues we expect to contribute to the knowledge of the molecular
terms governing the T. cruzi-host cell interplay, focusing on the role of TcCRT in
particular inside the infected host cell. To reach this goal we will aim at validating the
specificity of the antibodies to be used as TcCRT detector probes to identify TcCRT
inside infected murine macrophages and, finally, to evaluate variations in surface
MHC-I molecules on infected murine macrophages. Thus, we specifically and
topographically monitor the TcCRT presence in parasites infecting a murine
macrophage cell line, as compared to free trypomastigotes and non-infective
epimastigotes. For that purpose, three different antibodies were tested as detector
probes for immunocytochemical procedures. Polyclonal and monoclonal anti-TcCRT
antibodies were validated as detector probes, as they showed minimal or null cross
reactivity. In immunocytochemistry, polyclonal rabbit, and monoclonal murine anti-
TcCRT antibodies, detected TcCRT with different sensitivities and specificities,
when revealed with immune probes conjugated to colloidal gold, followed by
transmission electron microscopy. With the rabbit polyclonal antibodies, CRT
particles were observed, both in free parasites and infected host cells, mainly in the
parasite nucleus and kinetoplast. With a murine monoclonal anti-TcCRT antibody,
and using larger size gold particles, a drastic improvement in sensitivity and
specificity for TcCRT detection, was obtained. TcCRT molecules were detected
mainly in the trypomastigotes kinetoplast. We propose that t his organelle may
represent a stopover for TcCRT, generated in the ER, previous its translocation to the
area of flagellum emergence. This mobilization may be influenced by the new environmental conditions that the parasite meets inside the host cell. It remains to be
determined the functional consequences of TcCRT cumulative presence in the
kinetoplast. The possibility that TcCRT regulates transcription in kinetoplast DNA, as
previously proposed for mammalian CRT in the nucleus, could be considered,
although the DNA organization in the kinetoplast is different. Also, TcCRT may
regulate Ca+2-dependent transduction signalling pathways. Finally, by unknown
mechanisms, T. cruzi infection seems to decrease the number of MHC class I positive
cells, as early as 2h post-infection. It remains to be determined whether TcCRT
accesses to the host cell ER and interferes in the MHC class I molecule-folding
process / Conicyt
Fondecyt
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/116939 |
| Date | 03 1900 |
| Creators | González Zúñiga, Andrea Elizabeth |
| Contributors | Ferreira Vigouroux, Luís, Galanti, Norbel Luis, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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