Memoria para optar el título de Bioquímico / Las Células Madre Mesenquimales (MSCs) se han convertido en un interesante campo de estudio. Inicialmente fueron estudiadas por su capacidad de diferenciarse a células de diversos tejidos mesodermales, sin embargo, con el paso de los años se determinó que las MSCs tenían una amplia capacidad de escapar del reconocimiento de células del sistema inmune. Más tarde se descubrió que las MSCs no solo tienen la capacidad de escapar del reconocimiento, sino que también son capaces de inhibir la activación y proliferación de células del sistema inmune. Diversas enfermedades autoinmunes y proinflamatorias están mediadas por linfocitos T, principales células efectores del sistema inmune adaptativo, por tanto, dadas las características inmunosupresoras de las MSCs, han sido propuestas como nueva estrategia terapéutica para el tratamiento de estas enfermedades. Con este objetivo, varios autores han enfocado sus estudios para determinar el mecanismo por el cual las MSCs ejercen este efecto inhibitorio. Algunos autores postulan que el contacto celular, entre MSCs y linfocitos, es indispensable para producir este efecto, sin embargo otros postulan que las MSCs secretan una amplia variedad de factores solubles inmunosupresores que son suficientes para producir el efecto inmunosupresor.
Dentro de las estirpes linfocitarias sobre las cuales las MSCs podrían ejercer su efecto inmunosupresor encontramos a los linfocitos T helper (TH), las cuales son células efectoras que se clasifican principalmente en: linfocitos TH1 que participan en la respuesta contra bacterias intracelulares, linfocitos TH2 que participan en la respuesta contra parásitos, linfocitos TH17 que participan en la respuesta contra bacterias extracelulares y hongos y, finalmente, los linfocitos T reguladores (Treg) cuya función es mantener la homeostasis del sistema inmune y promover la tolerancia inmunológica frente a antígenos propios.
Durante más de una década fue ampliamente descrita la capacidad inmunosupresora de las MSCs sobre linfocitos T, sin embargo en los últimos años se ha descrito que bajo ciertas condiciones las MSCs producen un efecto estimulador sobre algunas de estas estirpes linfocitarias.
El objetivo de este estudio fue determinar si las MSCs suprimen la proliferación y diferenciación de linfocitos TH1 y TH17. Estos linfocitos fueron estudiados ya que se ha descrito que diversas enfermedades autoinmunes se caracterizan por un aumento o desbalance de estas estirpes. Para esto, investigamos si es que el efecto inmunomodulador de las MSCs era dependiente del estado de activación y diferenciación de linfocitos, del ratio MSCs:CD4+, del contacto celular o de factores solubles.
Dado que ha sido ampliamente descrito que las MSCs son capaces de secretar basalmente IL-6, la cual corresponde a una citoquina que cumple diversas funciones sobre el sistema inmune, entre ellas promover la secreción de citoquinas y factores de crecimiento necesarias para la respuestas de linfocitos T y que además son capaces de promover la estirpe, altamente proinflamatoria, TH17, y que esta secreción aumenta cuando las MSCs se encuentran frente a estímulos proinflamatorios como IFN-γ o TNF-α, postulamos que la IL-6 secretada por las MSCs es el principal factor soluble involucrado en la inmunomodulación ejercida por las MSCs.
Las MSCs fueron obtenidas a partir de médula ósea de ratones C57BL/6 y caracterizadas por el patrón de expresión de antígenos de superficie y por su capacidad de multidiferenciación. Los linfocitos T CD4+ fueron obtenidos a partir de bazo de ratones C57BL/6, purificados mediante kit comercial y cultivados en presencia de citoquinas que favorecen la diferenciación hacia la estirpe TH1 o TH17. Las MSCs fueron agregadas a los cultivos de linfocitos TH1 o TH17 a distintos tiempos de cultivo celular en presencia o ausencia de contacto celular, contacto MSCs-linfocito. La diferenciación de los linfocitos fue medida por medio de la detección de citoquinas intracelulares características de ambas estirpes, IFN-γ e IL-17 para linfocitos TH1 y TH17 respectivamente, por medio de citometría de flujo.
Demostramos que las MSCs son capaces de inhibir a linfocitos TH1 independiente del estado de activación y del ratio MSCs:CD4+. Determinamos que el efecto inmunosupresor está presente incluso en condiciones donde no existe contacto celular y que este efecto es independiente de la IL-6 secretadas por las MSCs.
A diferencia de lo que ocurre con linfocitos TH1, las MSCs sólo son capaces de inhibir a linfocitos TH17 cuando estas son agregadas a tiempo temprano al cultivo celular y este efecto es dependiente del contacto celular, mientras que cuando las MSCs son agregadas al cultivo a tiempos tardíos, al día 4 de cultivo celular, promueven la diferenciación de linfocitos TH17.
Concluimos que el efecto inmunomodulador que ejercen las MSCs sobre linfocitos TH1 y TH17 es por medio de mecanismos diferenciales. El efecto inmunosupresor sobre linfocitos TH1 es independiente de IL-6, sin embargo, no ha sido posible determinar el efecto real que ejerce la IL-6 secretada por las MSCs sobre linfocitos TH17 ya que la diferenciación de linfocitos TH17 requiere de IL-6 en el medio de cultivo. Sin embargo, determinamos que las MSCs en baja concentración no solo pierden su capacidad inhibitoria cuando se encuentran con linfocitos TH17 diferenciados sino que son capaces de promover su diferenciación. Observamos también que la IL-6 proveniente de MSCs podría, bajo ciertas, de revertir este efecto / Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have become an interesting field of study. Initially MSCs where studied for their capacity to differentiate into various cell types from different tissues from the mesoderm, however, over the years was determined that MSCs have a large capacity to escape from the recognition by cells from the immune system. Later it was discovered that MSCs not only have the capacity to escape recognition, but are also able to inhibit the activation and proliferation of immune cells. Several autoimmune and proinflammatory diseases are mediated by T cells, major effectors cells of the adaptive immune system, therefore, given the immunosuppressive properties of MSCs they have been proposed as a new therapeutic strategy for treating these diseases. To this end, several authors have focused their studies to determine the mechanisms by which MSCs exert this inhibitory effect. Some authors postulate that cell contact between MSCs and lymphocytes is essential to produce this effect, while others postulate that MSCs secrete a wide variety of immunosuppressive soluble factors that are sufficient to produce the immunosuppressive effect on T lymphocytes.
MSCs can exert their immunosuppressive effect on lymphocytes called T helper (TH), which are an effectors cell line mainly classified into: TH1 cells that participate in the response against intracellular bacteria, TH2 cells that participate in the response against parasites, TH17 cells that participate in the response against extracellular bacteria and fungi. Finally there are T regulatory (Treg) cells which main function is to maintain immune system homeostasis and to promote immunologic tolerance against self antigens.
For over a decade, it was widely described the immunosuppressive capacity of MSCs on T lymphocytes, however in recent years it has been described that under certain conditions MSCs may produce a stimulatory effect on some of these lymphocytes strains.
The aim of this study was to determine whether MSCs are able to suppress TH1 and TH17 proliferation and differentiation. These cells were studied because it has been previously described that many autoimmune disease are characterized by and increase or imbalance of this two strains. For this purpose, we investigated whether de immunomodulatory effect of MSCs was dependent on lymphocytes activation and differentiation state, MSCs: CD4+ ratio, cell contact or soluble factors.
It has also been highly described that MSCs are able to secrete basal amounts of IL-6, cytokine which has a variety of function on the immune system, among them, to promote cytokine and growth factor secretion necessary for T cell response, and to promote differentiation of the highly proinflammatory TH17 cells. These IL-6 basal secretion is augmented when MSCs are in presence of proinflammatory stimulus like IFN-γ or TNF-α, thus we postulate that MSCs secreted IL-6 main soluble factor involved in MSCs immunomodulation.
MSCs were obtained from mice bone marrow and characterized by their surface antigen expression pattern and their capability of multilineage differentiation. CD4+ T cells were obtained from mice splenocytes, purified by a commercial Kit and cultivated with cytokines that promote the differentiation to TH1 or TH17 cells. MSCs were added to TH1 or TH17 cultures at early or late time points and in the presence or absence of cell to cell contact, MSCs-T cell contact, mediated by a transwell system. The differentiation of TH1 or TH17 cell was measured by the detection of intracellular cytokines characteristics for each population, IFN-γ and IL-17 for TH1 and TH17 cells respectably, by flow cytometry.
We demonstrated that MSCs are capable to suppress TH1 cells differentiation despite on their state of activation or MSCs:CD4+ ratio. We determined that the immune suppressor effect of MSCs is present even in the absence of cell to cell contact and that this effect is independent of MSCs secreted IL-6.
In contrast with TH1 cells, MSCs are only capable to suppress TH17 cells when added at early time points of cell culture and that this effect requires cell to cell contact, while promoting TH17 differentiation when added at later time points, at day 4 of cell culture.
We concluded that the immune modulator effect of MSCs on TH1 and TH17 cells is mediated by differential mechanism. The immune suppressor effect on TH1 cells is independent from IL-6, though it was not possible to determined de real effect of MSCs secreted IL-6 over TH17 cells, since the TH17 differentiation media requires IL-6. However, we determined that low concentration of MSCs in the coculture, fail to inhibit TH17 differentiation more over they promote an augmentation of TH17 cells. We also observed that under certain culture conditions MSCs secreted IL-6 may revert this effect
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/132032 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Fernández Barriga, Ximena Beatriz |
| Contributors | Puente Piccardo, Javier, Carrión Arriagada, Flavio, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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