Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La fibrosis quística es la enfermedad genética letal más común en la población de origen caucásico y es causada por la mutación en el gen regulador de la conductancia transmembranal de la fibrosis quística, CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator) el cual forma un canal de cloruro en la membrana celular.
En los pacientes con fibrosis quística el sistema más afectado, en la mayoría de los casos, es el respiratorio donde el microorganismo aislado con mayor frecuencia es Pseudomona aeruginosa cuya infección produce una gran infiltración neutrofílica, la cual se caracteriza por la liberación de especies reactivas de oxigeno tales como peróxido de hidrógeno, anión superóxido y ácido hipocloroso. El daño tisular es una consecuencia directa de este ambiente oxidativo creado por la respuesta inflamatoria.
Se ha demostrado que CFTR frente a este estrés oxidativo aumenta su actividad donde además de conducir cloruro, mediaría el flujo del antioxidante glutatión al ser estimulado por H2O2 y que la salida de glutatión desencadenaría la apoptosis celular. Este mecanismo sería relevante para prevenir la injuria por estrés oxidativo en el caso de la infección por P. aeruginosa, así como para iniciar la apoptosis y evitar la muerte por necrosis que resulta perjudicial para la mantención de la homeostasis del epitelio.
Antecedentes anteriores demuestran que CFTR actuaría además como receptor bacteriano de P. aeruginosa con la consiguiente descamación de la
célula infectada y que juega un papel primordial en la regulación de la viscosidad del mucus de las vías aéreas.
Todos estos mecanismos se ven afectados en los pacientes con fibrosis quística, donde se observa hiperviscosidad del mucus, muerte necrótica con la liberación de detritus celulares que llevan a una respuesta inflamatoria exagerada y un aumento del estrés oxidativo.
Para examinar la hipótesis de que frente al estrés oxidativo las células responderían aumentando la cantidad de proteína total CFTR, se seleccionaron dos clones de células HEK 293, establemente transfectadas con CFTR (HEK-CFTR), clon 1 y clon 4, los cuales se sometieron a cuatro concentraciones distintas de peróxido de hidrógeno 100 M, 200 M, 400 M y 500 M durante 16 horas. Se realizaron además experimentos de discriminación del efecto directo del H2O2 y/o del radical .OH (hidroxilo) coincubando las placas con H2O2 a las mismas concentraciones anteriores y MCI - 186 un atrapador específico de radicales hidroxilo a una concentración de 500 M. La proteína total CFTR se determinó mediante “inmunoblot” y análisis computacional de las bandas.
Finalmente se evaluó el porcentaje de muerte celular por conteo de células de muestras a 100 M, 400 M y 500 M.
En los experimentos de clon 1 y clon 4 se determinó que existía un aumento en la expresión del canal a bajas concentraciones de estrés oxidativo, pero este aumento no fue estadísticamente significativo. Además se determinó que el exceso de oxidantes en el medio afecta la funcionalidad celular demostrándose esto con una menor expresión génica basal
En los experimentos con el uso del atrapador de radicales hidroxilo, se observó una tendencia similar a los experimentos anteriores donde la expresión de la proteína aumentaba en relación a la concentración de agente oxidante, por lo que se concluyó que el efecto observado se debía en gran parte al peróxido de hidrógeno y no al radical hidroxilo.
Finalmente en la evaluación de la mortalidad celular, se encontró que ésta aumentaba en forma directamente proporcional al aumento de la concentración del agente oxidante, pero que no influía en términos absolutos en la expresión final de la proteína.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/133950 |
| Date | January 2006 |
| Creators | Moyano Rugiero, Natalia |
| Contributors | Stutzin Schottlander, Andrés, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Departamento de Ciencias Biológicas Animales, Galleguillos Caamaño, Marco, Arias Bautista, José Luis |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Atribución-NoComercial-SinDerivadas 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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