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Estudio de los mecanismos de regulación de la autofagia por BAG3

Doctora en Bioquímica / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / La macroautofagia (autofagia) es una vía de reciclaje caracterizada por la formación de vesículas de doble membrana denominadas autofagosomas que secuestran estructuras citoplasmáticas marcadas para su degradación. La formación del autofagosoma requiere la actividad de proteínas relacionadas con la autofagia (Atg) que median algunas de las cuatro etapas principales de la autofagia: iniciación, nucleación, expansión y cierre. La proteína MAP1LC3B (referida sólo como LC3) es una de las Atg más importantes ya que ayuda a elongar la membrana y reclutar al cargo. Su forma lipidada (LC3-II) se encuentra en ambas superficies del autofagosoma (externa e interna) donde se degrada con su cargo cuando el autofagosoma se fusiona con el lisosoma.
La autofagia se regula principalmente por modificaciones post-traduccionales y modificaciones lipídicas de las proteínas Atg. Además, en algunos escenarios, la inducción de la autofagia se acompaña de aumentos en los niveles de mRNA de ciertos genes asociados a la autofagia, como LC3, ATG5 o ATG12. Sin embargo, prácticamente se desconocen los mecanismos que controlan la traducción de las proteínas Atg.
Estudios recientes con la cochaperona Bag3 han mostrado controlar la degradación selectiva de proteínas mal plegadas a través de autofagia, incluyendo huntingtina con expansiones de poli-Q y SOD1 mutante. El mecanismo involucra la asociación de Bag3 a dineína y microtúbulos para el transporte de proteínas mal plegadas a los agresomas, facilitando su eliminación por la autofagia. Además del papel en el plegamiento y degradación de proteínas, recientemente se ha descrito que la chaperona Hsp70 regula la traducción de proteínas.
Los últimos trabajos muestran que Bag3 es una proteína que induce la lipidación LC3 pero no hay antecedentes sobre el mecanismo utilizado. En esta tesis se estudió cómo Bag3 controla la autofagia en células HeLa. Para este fin Bag3 se silenció con un siRNA ó shRNA, o se expresó con plasmidios. Los niveles de mRNA, proteínas y estado de fosforilación de varias proteínas Atg, particularmente de LC3I y LC3II, mTOR y AMPK. Además, se determinó si Bag3 es necesaria para la inducción de la autofagia en condiciones de estrés como la privación de nutrientes e inhibición del proteasoma.
Los resultados mostraron que Bag3 mantiene los niveles basales de la proteína LC3 en células HeLa, controlando la traducción de su mRNA. El efecto de Bag3 es aparentemente específico para LC3 dado que otras proteínas Atg no fueron afectadas. De hecho, la conversión de LC3I a LC3II por inductores autofagia, como la privación de nutrientes y la inhibición del proteosoma, no se observó afectada. Se concluye que Bag3 regula niveles proteicos totales de LC3, manteniendo su traducción / Macroautophagy (autophagy) is a recycling pathway characterized by the formation of double-membrane vesicles called autophagosomes, which sequester cytoplasmic structures targeted for destruction. Autophagosome formation requires the activity of autophagy-related proteins (Atg), which are shown to participate in the four major steps: initiation, nucleation, expansion and closure. MAP1LC3B (referred only as LC3) is most important Atg protein, aiding to elongate the membrane and recruit the cargo. The lipidated form of LC3 (LC3-II) lies on both surfaces of autophagosome (external and internal) where it degrades with its cargo when the autophagosome fuses with the lysosome.
Autophagy is mainly regulated by post-translational modifications and lipid modifications of Atg proteins. Moreover, in some scenarios, the induction of autophagy is accompanied by an increase in the mRNA levels of certain genes associated to autophagy, such as LC3, ATG5 or ATG12. However, less work has done on the study of mechanisms controlling translation of the Atg proteins.
In recent studies, Bag3 has shown to control the selective degradation of misfolded proteins by autophagy, including polyQ-expanded huntingtin and mutant SOD1. The mechanism involves Bag3 association to dynein and microtubules to transport misfolded proteins to the aggresomes and facilitates their clearance by autophagy. Besides the role in folding and degradation of proteins, recently has shown a role of the Hsp70 chaperone in the regulation of the translation of proteins.
The last reports show that Bag3 is a protein that induces LC3 lipidation but little is known about the mechanisms used. In the present work, we study how Bag3 controls the autophagy pathway in HeLa cells. Bag3 was knockdown with siRNA or shRNA, or expressed with plasmids. mRNA levels, protein levels and phosphorylation status of several Atg, particularly of LC3I and LC3II, mTOR and AMPK were evaluated. In addition, it was determined whether Bag3 is required for the induction of autophagy in stress conditions such as nutrient deprivation and inhibition of the proteasome.
Our results showed that Bag3 maintains the basal protein levels of LC3 in HeLa cells, controlling the translation of its mRNA. This effect was apparently specific for LC3 because the levels of other Atg proteins remained unchanged. The LC3I conversion to LC3II did not alter by autophagy inductors such as nutrient deprivation or proteasome inhibition. We concluded that Bag3 maintains the basal protein levels of LC3, controlling the translation of its mRNA / Conicyt
Fondecyt
Fondap
Proyecto Anillo ACT 1111

Identiferoai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/136770
Date January 2015
CreatorsRodríguez Villarroel, Andrea Elizabeth
ContributorsLavandero González, Sergio, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
PublisherUniversidad de Chile
Source SetsUniversidad de Chile
LanguageSpanish
Detected LanguageSpanish
TypeTesis

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