Magíster en Bioquímica Área de Especialización en Bioquímica Clínica Aplicada y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Durante la progresión tumoral las células epiteliales malignas pierden su polaridad, disminuyen la adhesión celular, aumentan la motilidad y adquieren capacidad invasiva. Este proceso se conoce como transición epitelio mesenquimal (TEM). En el cáncer de próstata (CaP) la disminución en la expresión de e-cadherina, que es inhibida por el factor de transcripción snail, se acompaña de una serie de otros cambios que facilitan el fenotipo mesenquimal. Las moléculas de adhesión celular (MACs)sindecano 1 y sindecano 2 cambian sus patrones de expresión y localización celular en relación a la agresividad del tumor prostático. A través de un análisis in silico, se ha descrito que existen sitios putativos de unión para snail en las regiones promotoras de los genes de sindecano 1ysindecano 2. El objetivo de esta tesis es demostrar que snail se une a regiones específicas de estos promotores reprimiendo su expresión en líneas celulares de CaP.
El presente trabajo se realizó utilizando líneas celulares comerciales de CaP de baja (LNCaP) y alta (PC3) capacidad tumorigénica. Se estudió la unión de snail a regiones promotoras de los genes de sindecano 1y 2, mediante ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y retardo en la movilidad electroforética en ambas líneas celulares. Para determinar si snail participa en la regulación transcripcional desindecano 1 ysindecano 2 se generó mediante infección con lentivirus una línea celular, LNCaP-Snail+, con sobreexpresión de snaily mediantePCR en tiempo real e inmunofluorescencia, se determinaron los niveles mRNA y proteínassnail,sindecano 1 y sindecano 2. Complementariamente se clonóel promotor de sindecano 1para evaluar, mediante ensayos de gen reportero con actividad luciferasa, el efecto de la sobreexpresión de snail en la regulación génica sindecano 1.
Los resultados obtenidos mediante ChIP en este estudio demuestran que existe una interacción de snailcon las dos zonas más próximas al sitio de inicio de la transcripción del promotor del gen de sindecano 1, pero que no existe interacción de snailcon la región promotora de sindecano 2.Se confirmó que los niveles del transcrito y proteína snail aumentanen la línea celular LNCaP-Snail+ en comparación con líneas controles. Al determinar el efecto de la sobreexpresión de snail no se observaron disminuciones en los niveles de mRNA y proteínas de las moléculas sindecano 1 y sindecano 2 cuando existía sobreexpresión de snail. El ensayo de gen reportero tampoco da cuenta de una represión en el promotor de los genes de sindecano 1en la línea celular LNCaP-Snail+.
Es posible concluir que existe unión de snail con dos regiones sólo en el promotor de sindecano 1, pero no existe una disminución en la expresión de esta molécula de adhesión en la línea celular LNCaP-Snail+. En el modelo estudiado no existe una disminución en la expresión de sindecano 1 y sindecano 2 cuando se sobreexpresa snail.Se propone que snail participa en la regulación génica de sindecano 1 en conjunto con otros represores transcripcionales que aún no han sido estudiados / During tumor progression epithelial cells lose their polarity, decrease their cell adhesion, increase their motility and acquire invasive capacity. This process is known as epithelial mesenchymal transition (EMT). In prostate cancer (PCa), the loss of e-cadherin, which is inhibited by the expression of snail, is accompanied by a number of other changes that facilitate the mesenchymal phenotype. The cellular adhesion molecules (CAMs) syndecan 1 and syndecan 2 change their patterns of expression and cellular localization in relation to prostate tumor aggressiveness. Through a in silico analysis, we have described putative snail binding sites in promoter regions of syndecan 1 and 2 genes. The aim of this thesis is to demonstrate that snail binds to specific regions of these promoters repressing their expression in PCa cell lines.
This work was performed using commercial PCa cell lines with low (LNCaP) and high (PC3) tumorigenic capacity. The snail binding to promoter regions of genes syndecan 1 and 2 was studied through chromatin immunoprecipitation (ChIP) and electrophoretic mobility shift assay in both cell lines. To determine whether snail participates in the transcriptional regulation of syndecan 1 and syndecan 2, a cell line (LNCaP-Snail+) with overexpression of snail was generated by infection with lentivirus, and through real time PCR and immunofluorescence, mRNA levels and protein snail, syndecan 1 and syndecan 2 were determined. Additionally promoter of syndecan 1 was cloned to evaluate, by reporter gene assays with luciferase activity, the effect of the overexpression of snail in gene regulation of syndecan 1.
The results obtained by ChIP in this study show that snail interacts with the two regions closer to the start site of transcription of the gene promoter syndecan 1, but no interaction of snail with the promoter region of syndecan 2. It was confirmed that the snail transcript and protein levels increase in LNCaP-Snail+ cell line compared to controls. The snail overexpression was not reduced syndecan 1 and syndecan 2 mRNA and protein levels. The reporter gene assay result also shows no repression in the promoter of the gene of syndecan 1 in the LNCaP-Snail+ cell line.
We conclude that there is snail binding with only two regions in the promoter of the syndecan 1 gene, but there is no decrease in the expression of this CAM in the LNCaP-Snail+ cell line. In this model study, snail was not involved in gene regulation of syndecan 1. It is proposed that snail is involved in gene regulation of syndecan 1 in conjunction with other repressor molecules that have not yet been studied
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/138382 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Seguel Fernández, Valentina Paz |
| Contributors | Contreras Muñoz, Héctor Ruberly, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Atribución-NoComercial-SinDerivadas 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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