Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Las vacunas de ADN son una terapia alternativa altamente atractiva para
combatir el cáncer. Esta estrategia consiste en la entrega in vivo de ADN
plasmidial codificante de antígenos tumorales que son expresados y presentados
por células dendríticas (DC) con el fin de activar linfocitos T capaces de eliminar
específicamente células tumorales. Un importante paso hacia la aplicación clínica
de las vacunas de ADN ha sido el uso de la electroporación in vivo, un método
de entrega altamente eficiente y clínicamente aplicable, que aumenta
considerablemente el ingreso de plásmidos al interior de las células. Sin
embargo, la mayoría de los antígenos tumorales son antígenos propios
expresados en células normales, por lo que el sistema inmune es incapaz de
discriminar a los tumores como agentes potencialmente peligrosos. Es así como
los esfuerzos para resolver estos inconvenientes se han enfocado, en parte, en
la búsqueda y elaboración de nuevas estrategias que sean capaces de promover
eficientemente la inducción de linfocitos T específicos contra estos antígenos
tumorales poco inmunogénicos.
El ADN usado en las vacunas puede ser reconocido por numerosos receptores
de la inmunidad innata, los cuales al ser activados, señalizan a través del factor
de transcripción NF-κB, induciendo la expresión de citoquinas proinflamatorias e
interferones de tipo I. NF-κB es un regulador maestro de la función de las DC y de la inducción de linfocitos T mediada por vacunas de ADN, por lo tanto, el desarrollo de adyuvantes que modulen su actividad representa una estrategia interesante para promover la inducción eficiente de linfocitos T antitumorales. IκBα es uno de los principales inhibidores de NF-κB, el cual además es un gen blanco de NF-κB, por lo que actúa en un sistema de retroalimentación negativa para detener la activación de esta vía. Por otro lado, el uso de shARN que silencian la expresión de reguladores negativos de las DC ha demostrado su capacidad como adyuvantes génicos en vacunas de ADN, al inducir una respuesta inmune antitumoral más potente. Por tanto, nuestra hipótesis plantea que un shARN contra IκBα es capaz de potenciar la activación de la inmunidad innata mediada por NF-κB y, como consecuencia, la magnitud de la respuesta inmune adaptativa específica contra el antígeno tumoral codificado.
En este proyecto se utilizaron plásmidos codificantes de un shARN contra IκBα como adyuvantes génicos para ser administrado junto a una vacuna de ADN que codifica para el antígeno tumoral TRP2. Se evaluó el efecto del silenciamiento de IκBα sobre la migración de las células dendríticas de la piel, particularmente sobre las células de Langerhans y sobre las células dendríticas dermales CD103+. La generación de linfocitos T específicos contra TRP2 se analizó en ratones vacunados mediante citometría de flujo y el efecto antitumoral in vivo se evaluó usando un modelo de profiláctico de melanoma metastásico y un modelo terapéutico de melanoma subcutáneo.
Los resultados de este trabajo indican que la administración de ADN plásmidial
en la piel incrementa la migración de células dendríticas hacia los nódulos
linfáticos drenantes y que la inhibición de la expresión de IκBα con un shARN en
el sitio de vacunación incrementa la migración de células dendríticas dermales
CD103+ hacia el nódulo linfático drenante. Además se observó que la
coadministración del shARN contra IκBα en conjunto con una vacuna de ADN
dirigida contra el antígeno tumoral TRP2 potencia la generación de linfocitos T
CD8 específicos e incrementa la respuesta inmune antitumoral en ensayos de
metástasis pulmonar y crecimiento tumoral utilizando el modelo de melanoma
murino B16F10. Dada la gran capacidad de las células dendríticas dermales
CD103+ para activar linfocitos T CD8 es posible correlacionar su incremento en
los nódulos linfáticos drenantes del sitio de vacunación con una mayor
generación de linfocitos T CD8 específicos contra TRP2 y con un incremento en
la respuesta inmune antitumoral contra melanoma cuando se coadministra el
shARN contra IκBα junto con una vacuna de ADN dirigida contra el antígeno
tumoral TRP2 / DNA vaccines are a highly attractive therapeutic alternative to treat cancer.
This strategy consists of in vivo delivering plasmid vectors encoding tumor
antigens, which are expressed and presented by dendritic cells (DC) in order to
activate T cells capable of specifically eliminating tumor cells. An important step
towards the clinical application of DNA vaccines has been the use of in vivo
electroporation, a highly efficient delivery method that is clinically applicable and
considerably increases plasmid uptake in cells. However, most of tumor antigens
are self-antigens expressed by normal cells, so that the immune system is unable
to recognize tumors as potentially dangerous agents. Thus, the efforts to solve
these inconvenient have been focused on developing new strategies to promote
the induction of T cells responses specific against such poorly immunogenic
tumor antigens.
DNA used for vaccines can be recognized by several innate immune receptors
that, upon activation, signal through the transcription factor NF-κB which induces
the expression of proinflamatory cytokines and type I interferons. NF-κB is a
master regulator of both DC function and DNA vaccine-mediated induction of T
cell responses, therefore the development of adjuvants that modulate NF-κB
activity represents an interesting strategy to promote the efficient induction of
antitumor T cell responses. IκBα is one of the major inhibitors and downstream target genes of NF-κB, therefore acting in a negative feedback loop to stop NF-
κB activation. The use of shRNA silencing negative regulators of DC function has
demonstrated its potential as genetic adjuvants for DNA vaccines by inducing
enhanced antitumor immune responses. Hence, our hypothesis states that a
shRNA targeting IκBα is able to promote the NF-κB innate immune activation and,
as a consequence, the magnitude of tumor antigen-specific adaptive immune
responses.
In this project, plasmid-encoded shRNA targeting IκBα were generated as genetic
adjuvants to be coadministrated with a DNA vaccine encoding the tumor antigen
TRP2.The effect of IκBα silencing was analyzed over the migration of skin
dendritic cells, particularly Langerhans cells and CD103+ dermal dendritic cells.
Generation of TRP2-specific T cells was studied in vaccinated mice by flow
cytometry and the in vivo antitumor effect was evaluated using prophylactic model
of metastatic melanoma and a subcutaneous model of melanoma.
The results obtained in this work shows that the inhibition of IκBα using a shRNA
increases the migration of CD103+ dermal dendritic cells to the skin draining
lymph nodes. Also the coadministration of the shRNA against IκBα and a DNA
vaccine against TRP2 enhance the generation of TRP2 specific CD8 T cells
increasing the antitumor immune response against melanoma. Finally due to the
high ability of CD103+ dermal dendritic cells to cross-present antigens and activate CD8 T cell is possible to correlate their increase in the migration with
higher levels of TRP2 specific CD8 T cells and higher antitumor immune response
when the shRNA against IκBα is coadministered with a DNA vaccine against
TRP2
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/140235 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Gálvez Cancino, Felipe Ignacio |
| Contributors | Puente Piccardo, Javier, Lladser Caldera, Alvaro Fernando, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Atribución-NoComercial-SinDerivadas 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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