Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. / El desarrollo de una respuesta inmune anti-tumoral requiere de la comunicación entre
diferentes células del sistema inmune, así como del reconocimiento de la célula
tumoral. Una vez que los Linfocitos T Citotóxicos (CTL) y las células Natural Killers
(NK) reconocen la célula tumoral, forman la Sinapsis Inmunológica Citotóxica (SIC),
una estructura supramolecular altamente especializada que resulta fundamental para la
liberación localizada de los gránulos citotóxicos y la eliminación específica de la célula
tumoral. Recientemente, se ha descrito la participación de canales Gap Junction (GJ)
formados por la isoforma Cx43 (GJ-Cx43) en la actividad citotóxica de las células NK
durante la SIC. A pesar de las similitudes funcionales y estructurales presentadas por
la SIC mediada por las células NK y por CTL, la participación de los canales GJ-Cx43
en la sinapsis mediada por CTL aún no ha sido determinada. En este trabajo se estudió
el rol de los canales GJ-Cx43 en la actividad de la SIC entre CTL obtenidos desde
ratones pMEL-1 y células de melanoma murino B16F10. Primero, se evaluó la
polarización de Cx43 hacia la zona de contacto entre CTL pMEL-1 y células B16F10,
durante la SIC. Se determinó que Cx43 se acumula en el sitio de contacto entre estas
células de manera antígeno específica y que esta polarización es dependiente de la
activación de los CTL. Luego, se disminuyó la expresión de Cx43 en células B16F10
utilizando un RNA interferente contra Cx43 y luego se evaluó la participación de Cx43
en la formación de canales GJ mediante ensayos de transferencia de calceína y en la
actividad citotóxica de los CTL, mediante ensayos de actividad de Granzima B (GrzB).
Se observó que los CTL transfieren calceína a las células B16F10 formando canales
GJ funcionales, al contrario de cuando se utilizan LT CD8+ vírgenes como células
efectoras. Además, cuando se utilizaron las células B16F10 que expresan bajos niveles de Cx43 como células blanco, se observó una disminución en la transferencia
de calceína y en la actividad de GrzB en comparación al control. Nuestros resultados
demuestran que durante el reconocimiento citotóxico se forman canales GJ-Cx43 entre
CTL y células B16F10 y que la formación de estos canales durante la SIC son
importantes para la eliminación de células tumorales mediada por CTL. / Development of antitumor immune responses requires communication between
different immune cells, and specific immune recognition of tumor cells. Upon tumor cell
recognition, CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells form the
“Cytotoxic Immunological Synapse (SIC)”, a specialized molecular structure
fundamental for the polarized delivery of cytotoxic granules and the specific tumor cell
killing. Recently, it has been described the participation of Gap Junction Intercellular
Communications formed by Connexin 43 (GJIC-Cx43) in the NK cell SIC activity.
Despite that CTL and NK cells present functional and structural similarities in SIC
formation, the participation of GJIC-Cx43 in CTL-mediated SIC remains unclear. In this
work we studied the role of GJIC-Cx43 in the activity of SIC formed between CTL from
pMEL-1 mice and B16F10 murine melanoma cells. First, we evaluated by
immunofluorescence the polarization of Cx43 to contact site between CTL and B16F10
during SIC. We found that this protein localizes at the contact site of SIC and this
polarization dependent on activation of CTL and is an antigenic-specific process.
Then, we decrease Cx43 expression in B16F10 cells using interference RNA against
Cx43 and we evaluated the participation of Cx43 in the formation of functional GJ
channels by calcein transfer assay and in the cytotoxic activity of CTL by Granzyme B
(GrzB) activity assay. We found that CTL transfer calcein to B16F10 forming functional
GJ in contrast with when we used a naïve CD8+ T cells as an effector cells. In addition,
when we used a B16F10 that express low levels of Cx43 as target cells, we observed a
decrease in calcein transfer and GrzB activity in comparison to the control. Our results
demonstrate that GJIC-Cx43 are formed between CTL and B16F10 during SIC, and
suggest that their formation is important for tumor cells-killing by CTL
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/152819 |
| Date | 08 1900 |
| Creators | Hoffmann Vega, Francisca Alejandra |
| Contributors | Salazar Onfray, Flavio, Sauma Mahaluf, Daniela, Tittarelli, Andrés, Nuñez, Marco Tulio, Bono, María Rosa, Universidad de Chile. Facultad de Ciencias. Escuela de Pregrado. |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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