Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / N6-Metiladenosina (m6A) es la modificación química más abundante encontrada en los ARN mensajeros (ARNm) de células eucariontes. Esta modificación regula el metabolismo de los ARNm a diferentes niveles incluidos el corte y empalme de exones, traducción, estabilidad y degradación. Existen tres grupos de proteínas que regulan estos procesos: aquellas que catalizan la adición de la modificación, las proteínas metiltransferasas METTL3 y METTL14, las que remueven la metilación, las desmetilasas FTO y ALKBH5, y finalmente, las que reconocen m6A y actúan como efectoras de esta modificación, las proteínas lectoras YTHDF1,2 y 3.
Recientemente se ha descrito la presencia de m6A en el ARN de diferentes virus que replican en el citoplasma, como los virus de la hepatitis C, virus Zika e influenza A, donde la modificación m6A regula la expresión de proteínas virales, estabilidad de los ARN virales (genómicos y mensajeros) y por ende la replicación viral. Sin embargo, se desconoce su rol en la replicación de otros virus de importancia clínica, como el virus respiratorio sincicial humano (VRSh).
VRSh es uno de los principales causantes de enfermedades respiratorias en menores de 3 años, adultos mayores e inmunodeprimidos. Es un virus que infecta células del tracto respiratorio replicando en el citoplasma de estas. Posee un ARN genómico de simple hebra de polaridad negativa y actualmente no existen vacunas licenciadas ni tratamientos antivirales para combatir su infección.
El objetivo de este trabajo fue determinar si las proteínas que participan en la adición, remoción y reconocimiento de m6A, tienen un impacto en la replicación del VRSh. Para esto, se sobreexpresaron las proteínas metiltransferasas, desmetilasas y lectoras en células HEK293T infectadas con VRSh y se estudió la expresión de la proteína viral de fusión (F) por Western Blot (WB). Además, se cuantificó los niveles del ARNm de F y el ARN genómico intra y extracelular mediante RT-qPCR bajo las mismas condiciones.
Los resultados obtenidos muestran que la sobreexpresión de las metiltransferasas disminuyó la expresión de la proteína F y los niveles del ARNg viral, mientras que la sobreexpresión de las desmetilasas tuvo el efecto contrario, sugiriendo que m6A afecta de forma negativa la expresión de proteínas virales y la replicación del genoma de VRSh.
Por otra parte, la sobrexpresión de las proteínas YTHDF1, 2 y 3 aumentó los niveles del ARNm de la proteína F, aunque disminuyó los niveles del ARNg del virus. Además, mediante ensayos de inmunoprecipitación de estas proteínas se observó que tanto YTHDF1, 2 y 3 se unen al ARNg de VRSh, sugiriendo que la modificación m6A se encuentra en el ARNg de VRSh.
En conjunto, estos resultados sugieren la presencia de m6A en el ARN de VRSh, posiblemente regulando la síntesis de ARN mensajeros y ARN genómico, al igual que la expresión de proteínas virales, mediado por la actividad de las proteínas YTHDF1, 2 y 3. / Octubre 2019
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/170153 |
| Date | 04 1900 |
| Creators | Figueroa Ahumada, Fabian |
| Contributors | Acevedo, Mónica, Soto Rifo, Ricardo, Bono Merino, María, Universidad de Chile. Facultad de Ciencias. Escuela de Pregrado. |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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