L’acide γ-aminobutyrique (GABA) est synthétisé par la plante en réponse à des stress abiotiques et biotiques dont l’infection par le pathogène bactérien A. tumefaciens. Des travaux antérieurs ont montré que le GABA induit, chez A. tumefaciens C58, l’expression d’une lactonase BlcC (=AttM) qui inactive ses propres signaux quorum-sensing (QS), donc module le transfert horizontal du plasmide Ti. La protéine périplasmique de liaison (Periplasmic Binding Protein, PBP) Atu2422 et le transporteur ABC Bra sont respectivement impliqués dans la perception et le transport du GABA. L’importation du GABA est nécessaire à l’induction de l’expression de BlcC, donc à la dégradation des signaux QS. Les caractéristiques structurales des récepteurs/senseurs du GABA ne sont connus ni chez les bactéries, ni chez les eucaryotes.Ce travail de doctorat a permis de définir la structure et la fonction de deux senseurs du GABA, les PBPs Atu2422 et Atu4243 d’A. tumefaciens C58.La structure cristalline d’Atu2422 a été résolue en présence de GABA ou d’acides aminés antagonistes de la liaison au GABA comme la proline et l’alanine. L'analyse structurale du site de fixation du ligand d’Atu2422 a permis d’identifier deux résidus clés, Phe77 et Tyr275, respectivement impliqués dans la sélectivité du ligand et la liaison du GABA. L’analyse phénotypique de mutants ponctuels a révélé le rôle crucial de ces deux résidus aminés dans l’interaction entre A. tumefaciens C58 et deux plantes hôtes, tomate et tabac. De plus, ces travaux ont défini les caractéristiques moléculaires d’une sous-famille de PBPs présentes chez différentes protéobacteries interagissant avec des hôtes eucaryotes et capables de fixer le GABA et des acides aminés compétiteurs comme la proline ou l’alanine.Ce travail a également révélé une deuxième PBP (appelée GABA2) impliquée dans la perception et l’importation du GABA chez A. tumefaciens. Cette PBP a été identifiée grâce au séquençage du génome et l’analyse du transcriptome de mutants spontanés, issus d’un mutant-KO atu2422 d’A. tumefaciens C58, mais devenus capables de transporter le GABA. La construction d’un mutant défectif pour la PBP GABA2 a permis d’évaluer son rôle dans la signalisation GABA et l’interaction A. tumefaciens-plante hôte. La structure cristalline de cette PBP en présence de GABA a permis d’identifier les résidus clés impliqués dans la fixation du GABA dont le rôle a été validé par l’analyse de mutations ponctuelles. Enfin, une analyse phylogénétique des orthologues de GABA2 a révélé leur présence au sein de nombreuses protéobactéries pathogènes et symbiotiques interagissant avec les plantes. L’ensemble de ces travaux aboutit à la proposition de deux modèles de référence quant aux mécanismes moléculaires associés à la perception du GABA, médiateur de communications inter-cellulaires et inter-organismes. Ce travail illustre l’association des approches de biologie structurale et de génétique pour la compréhension des interactions plantes-microorganismes. / Γ-aminobutyric acid (GABA) is synthesized by plants in response to abiotic and biotic stresses, including infection with A. tumefaciens. Previous works have revealed that GABA induces the expression of the A. tumefaciens BlcC (=AttM) lactonase, which cleaves quorum-sensing (QS) signals, thus modulates QS-regulated functions such as horizontal transfer of the plasmid Ti. Periplasmic binding protein (PBP) Atu2422 and ABC transporter Bra of A. tumefaciens are involved in GABA transport from plant to A. tumefaciens. The structural characteristics of the receptors/sensors of GABA are still unknown in bacteria or eukaryotes.I have studied two GABA-binding PBPs of A. tumefaciens C58, Atu2422 and Atu4243 by a combination of structural, genetic and functional approaches.The crystal structure of Atu2422 was solved in the presence of GABA and competitive amino acids, such as proline and alanine. Structural analysis of the ligand binding site revealed two key residues, Phe77 and Tyr275, which are involved in the ligand selectivity and GABA binding, respectively. Analysis of two constructed point-mutants confirmed the critical role of these two residues in the interaction between A. tumefaciens C58 and two host plants, tomato and tobacco plants. Using characteristics of the GABA-binding site, a subfamily of GABA-PBPs was identified in Proteobacteria of which most of them interact with eukaryotic hosts.This work also revealed a second PBP (GABA2) involved in the GABA uptake in A. tumefaciens. This PBP was identified by whole-genome sequencing and transcriptomic analysis of two spontaneous mutants, which derived from the atu2422 mutant. A mutant GABA2 was constructed to validate GABA2 involvement in the transport of GABA, degradation of QS signal, conjugal transfer of the plasmid Ti, and aggressiveness of A. tumefaciens. X-ray structure of GABA-liganded PBP GABA2 revealed key-residues required for GABA-binding. Their role in the GABA uptake has been confirmed by analysis of point mutations. A phylogenetic approach showed that all GABA2-related proteins exhibiting these key-residues were clustered in the same PBPs subfamily.This study has contributed to a better understanding of the A. tumefaciens-plant host interaction, and has permitted to determine two GABA binding modes for PBPs.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2011PA112307 |
| Date | 01 December 2011 |
| Creators | Planamente, Sara |
| Contributors | Paris 11, Faure, Denis, Morera, Solange |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image |
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