Les protéines de choc thermique Hsp70 [70 kDa Heat Shock Protein] sont considérées comme des chaperons moléculaires très importants qui assistent au repliement des protéines naissantes ainsi qu’au repliement des protéines dénaturées en condition de stress dans le milieu intracellulaire. Les protéines Hsp70 sont présentes chez tous les organismes, tels que l’humain, la bactérie ou encore la levure et ont pour propriété d’avoir une séquence d’acides aminés hautement conservée entre les différentes espèces. [...] Ainsi la connaissance à l’échelle atomique des structures de la protéine hHsp70 dans ses conformations ouverte et fermée est un prérequis essentiel pour comprendre les interactions entre les deux domaines NBD et SBD de la protéine et pour élucider les mécanismes de communication inter-domaine. Cependant, il n’existe pas de structure expérimentale complète de la protéine hHsp70. Dans cette thèse, nous présentons les structures « tout-atome » des conformations ouverte et fermée de la protéine hHsp70, qui ont été modélisées par homologie à partir de la structure par diffraction des rayons X [DRX] de la protéine Hsp110 de la levure Sacharomyces cerevisae [dans la conformation ouverte] et à partir de la structure résolue par Résonance Magnétique Nucléaire [RMN] de la protéine Hsp70 de la bactérie E. coli [dans la conformation fermée]. Ces deux modèles structuraux de la protéine humaine Hsp70, dans les états ouvert et fermé, ont ensuite été relaxés par dynamique moléculaire non biaisée à la température de 300K en utilisant un solvant explicite sur une échelle de temps respectivement de 2.7 et 0.5 μs. L’hétérogénéité conformationelle de la protéine hHsp70 observée dans les simulations de dynamique moléculaire a été comparée à celle extraite d’expériences de resonance par transfert d’énergie entre fluorophores [FRET pour Förster resonance energy transfer] et de diffraction aux petits angles [SAXS pour Small Angle X-ray Scattering] effectuées sur des protéines homologues à hHsp70. [...] Une fois les structures 3D « tout-atome » résolues, la transition entre la conformation ouverte et la conformation fermée [et vice-versa] des protéines Hsp70 a été étudiée en utilisant deux techniques de simulations numériques : une analyse des modes normaux [Normal Mode Analysis où NMA] de la protéine Hsp70 dans chacune de ces deux conformations et une nouvelle méthode développée au cours de cette thèse, basée sur le concept de paysage d’énergie libre [Free-Energy Landscape où FEL]. [...] Cette étude a également permis d’identifier les sous-domaines et résidus clés qui apparaissent comme jouant un rôle important dans la dynamique conformationelle de la protéine Hsp70 dans l’approximation harmonique. Pour comprendre comment la fixation du nucléotide dans le domaine NBD peut engendrer un changement important de conformation de la protéine Hsp70, nous avons réalisé des simulations de dynamique moléculaire tout-atome non biaisée [sur une échelle de temps de 2 μs] de la protéine Hsp70 de la bactérie E. coli [appelée E. coli DnaK], dans trois conditions de nucléotides différentes [liée à l’ATP, liée à l’ADP et sans nucléotide]. [...] Finalement, en combinant l’analyse des modes normaux et du paysage d’énergie libre de la protéine Hsp70, nous avons pu établir une liste de résidus et de structures locales impliqués dans la dynamique conformationelle et dans les mécanismes de communication de la protéine hHsp70. La plupart de ces résidus ont été identifiés expérimentalement comme jouant un rôle crucial dans la communication entre les domaines NBD et le domaine SBD de protéines Hsp70 homologues. Notre étude nous a également permis d’identifier de nouveaux résidus clés. Ces nouveaux résidus pourraient être testés expérimentalement par mutagénèse et leurs positions pourraient être de nouvelles cibles pour la fixation d’inhibiteurs de fonctions biologiques de Hsp70, notamment dans le cas de tumeurs cancéreuses. / The 70 kDa heat shock proteins [Hsp70s] are key molecular chaperones which assist in the correct folding of nascent proteins and refolding of proteins under stress conditions in the intracellular environment. Hsp70s are present in all organisms and are highly conserved between the different species. [...] The conformational dynamics between the two conformations is governed by the ATP binding, ATP hydrolysis and by nucleotide exchange through an allosteric mechanism which is not fully understood.Knowledge of the conformations of hHsp70 at the atomic level is central to understand the interactions between its NBD and SBD. However, no complete structure of hHsp70 is known. In the present thesis, we report two conformations of hHsp70, constructed by homology modeling from the yeast Saccharomyces cerevisiae co-chaperone protein Hsp110 [openconformation] and from the bacteria Escherichia coli Hsp70 [closed conformation]. The open and closed conformations of hHsp70 built by homology were relaxed by using unbiased all-atom molecular dynamics [MD] simulations at 300 K in explicit solvent on a timescale of 2.7 and 0.5 μs, respectively. The conformational heterogeneity of hHsp70 observed in MD simulations was comparedwith those extracted from single-molecule Forster resonance energy transfer [FRET]experiments and to small-angle X-ray scattering [SAXS] data of Hsp70 homologs. [...] In the present thesis, the transitions between the open and closed conformation of Hsp70s were studied by using two different computational methods: the Normal Mode Analysis [NMA] and a new method developed in the present thesis based on the Free-Energy Landscape [FEL] concept.[...] These collective modes provide a mechanistic representation of the communication between the NBD and the SBD and allow us to identify subdomains and residues that appear to have a critical role in the conformational dynamics of Hsp70s in the harmonicapproximation. Second, in order to understand how the nucleotide binding in the NBD of Hsp70 induces a conformational change of the whole protein, we performed unbiased all-atom MD simulations [2 μs] of E. coli Hsp70 [named E. Coli DnaK], in three different nucleotide-binding states [ATPbound,ADP-bound and nucleotide free]. [...] Finally, by combining the NMA and the FEL analysis, we established a list of the local structures and of the residues relevant for the conformational dynamics and for the interdomain communication in hHsp70. Most of these residues could be related to previous experimental evidences of their role in the interdomain communication between the NBD and SBD domains of Hsp70 homologs but other were never identified before. All the relevant residues found in MD could be tested experimentally by mutational analysis and could be crucial locations to dock small peptides and for the design of inhibitors for the cancer therapy
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2012DIJOS060 |
| Date | 26 November 2012 |
| Creators | Nicolaï, Adrien |
| Contributors | Dijon, Senet, Patrick, Delarue, Patrice |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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