La Directive Cadre Européenne sur l'eau impose d'évaluer la qualité des cours d'eau au moyen d'indicateurs chimiques et biologiques dont les diatomées font partie. Les indices basés sur la composition taxonomique et l'abondance relative des taxa de diatomées sont robustes. Cependant, de nombreux échantillons doivent être analysés chaque année alors que l'identification de ces micro-algues en microscopie optique est difficile à cause des incertitudes taxonomiques, et nécessite temps et expertise. Ainsi, des améliorations peuvent encore être apportées pour faciliter le suivi en routine de la qualité de l'eau. Les techniques de biologie moléculaire sont des outils efficaces pour identifier les microorganismes et pourraient donc être utilisées pour améliorer l'identification des diatomées. Les objectifs de cette thèse étaient donc de compléter les connaissances sur la taxonomie des diatomées d'eau douce par des méthodes moléculaires et de progresser dans le développement d'un outil moléculaire permettant l'identification des diatomées dans des échantillons naturels, en vue de son utilisation en bioindication. L'étude de la taxonomie de plusieurs groupes de diatomées a été réalisée en combinant des approches morphologiques et des approches moléculaires. Nos travaux ont montré les capacités des séquences ADN pour discriminer les taxa de diatomées et révéler leurs relations phylogénétiques. L'utilisation de séquences ADN a montré que les critères morphologiques utilisés pour identifier les diatomées ne correspondaient pas systématiquement à leurs relations phylogénétiques. L'utilisation de différents marqueurs a permis des discriminations à différents niveaux taxonomiques. Nos résultats ont également révélé l'importance de combiner des approches complémentaires, morphologiques et moléculaires, pour améliorer notre compréhension des relations entre les différents taxa de diatomées et ainsi stabiliser leur taxonomie. Les séquences ADN permettant une discrimination des taxa de diatomées, nous avons testé un outil moléculaire de séquençage haut-débit, le pyroséquençage 454, dans le but d'identifier les taxa composant les communautés de diatomées. Nous avons ainsi assemblé des bases de séquences de référence bénéficiant d'une identification taxonomique. Nous avons également participé au développement d'outils bioinformatiques nécessaires à l'analyse des données de pyroséquençage. Enfin, nous avons pu tester ces outils pour établir des inventaires taxonomiques de diatomées dans des communautés artificielles (mélanges de souches) et dans des communautés environnementales (biofilms d'eau douce). Ces études ont prouvé le potentiel du pyroséquençage 454 pour étudier les communautés de diatomées à des niveaux taxonomiques précis. La comparaison de différents marqueurs nucléiques a révélé que le marqueur rbcL était le marqueur le plus adapté à l'identification des diatomées par pyroséquençage. En effet, en prenant en compte les bases de séquences de référence, la reproductibilité et les biais de la méthode ainsi que le pouvoir résolutif du marqueur, l'utilisation du rbcL a permis la meilleure estimation de la composition en diatomées d'échantillons complexes. Des progrès devront encore être faits avant de pouvoir utiliser les outils moléculaires pour évaluer la qualité de l'eau par les diatomées. Cependant nos différentes études permettront de guider les prochaines analyses de manière à aboutir à un suivi de la qualité de l'eau basé sur des inventaires moléculaires des taxa de diatomées. / The European Water Framework Directive requires assessing the river quality using chemical and biological indicators among which are diatoms. Indices based on taxonomic composition and relative abundance of diatom taxa are robust. However, thousands of diatom samples are analyzed every year while microscopic identification is difficult due to taxonomic uncertainties, and requires time and expertise. Thus, it is still possible to improve the routine monitoring of water quality. The molecular biology techniques are accurate tools to identify microorganisms and could be used to enhance diatom identification. The objectives of this thesis were therefore to improve our knowledge on the freshwater diatom taxonomy by molecular methods and to progress in the development of a molecular tool in order to identify diatoms in natural samples, thus improving bioindication tools. The taxonomic study of several groups of diatoms was achieved by combining morphological and molecular approaches. Our results showed the capacity of DNA sequences to discriminate diatom taxa and revealed their phylogenetic relationships. The use of DNA sequences showed that the morphological criteria used to identify diatoms do not correspond systematically to their phylogenetic relationships. The use of different markers allowed discrimination at different taxonomic levels. Our results also revealed the importance of combining complementary approaches, morphological and molecular, to improve our understanding of the relationships between different diatom taxa and thus stabilize their taxonomy. As DNA sequences allowed discrimination of diatom taxa, we tested a molecular tool of high throughput sequencing, 454 pyrosequencing, in order to identify the diatom composition of communities. We assembled reference libraries of sequences linked to taxonomic identification and we contributed to the development of bioinformatic tools required to analyze data from pyrosequencing. Finally, we tested these tools to establish taxonomic inventories of diatoms in artificial communities (mixtures of strains) and environmental communities (freshwater biofilm samples). The studies showed the potential of 454 pyrosequencing to accurately analyze diatom communities. The comparison of different nucleic markers revealed that the rbcL marker was the most suitable to identify diatoms using pyrosequencing. Indeed, taking into account reference libraries, reproducibility and bias of the method, and the resolving power of marker, the use of rbcL allowed the best estimation of the diatom composition in complex samples. Improvements will be necessary to use molecular tools in order to assess water quality using diatoms. However our studies lead the way for future experiments in order to achieve a monitoring of water quality based on molecular inventories of diatom taxa.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2012GRENA010 |
| Date | 04 May 2012 |
| Creators | Kermarrec, Lénaïg |
| Contributors | Grenoble, Bouchez, Agnès, Humbert, Jean-François |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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