La graine de soja contient de grandes quantités d'isoflavones (génistéine, daidzéine et glycitéine). En raison de leurs propriétés phytoestrogéniques, ces composés peuvent avoir des effets bénéfiques sur la santé humaine, mais ils peuvent aussi être perçus comme perturbateurs endocriniens, en particulier dans les laits pour nourrissons. La teneur et la composition en isoflavones de la graine diffèrent selon la fraction considérée. Les cotylédons contiennent de la génistéine et de la daidzéine, tandis que les germes, avec une teneur quatre à dix fois supérieure, contiennent majoritairement de la daidzéine et de la glycitéine. Le génotype influence fortement la teneur en isoflavones totales. Le déterminisme du pourcentage des isoflavones est essentiellement génétique. Ce travail porte sur l'étude du déterminisme génétique à l'origine des variations de teneurs et de compositions en isoflavones dans les germes et les cotylédons de la graine, en tenant compte également du net décalage de l'accumulation entre ces deux compartiments, au cours du développement de la graine. Dans un premier temps, les gènes des isoflavone synthases (IFS) de variétés très différenciées pour leurs teneurs et profils d'isoflavones ont été séquencés, puis les expressions des gènes clefs de la biosynthèse (neuf chalcone synthases (CHS), une chalcone réductase (CHR), quatre chalcone isomérases (CHI) et les deux isoflavone synthases (IFS) ont été suivies par RT-PCR quantitative dans les cotylédons et dans les germes, à trois stades critiques du développement de la graine (25, 40 et 60 jours après floraison). La seconde partie de ce travail a été consacrée à l'étude de l'expression de différents gènes candidats de la flavonoïde 6-hydroxylase (F6H) catalysant la première étape de la synthèse de la glycitéine. Le polymorphisme des séquences génomiques IFS1 et IFS2 des isoflavone synthases n'a pas montré de lien avec les différences de teneurs en isoflavones entre les variétés. L'activité transcriptionnelle des gènes de biosynthèse des isoflavones souligne l'existence d'une régulation bien distincte de cette synthèse dans ces deux compartiments. Les taux d'expression des gènes cibles ne sont pas toujours reliés avec les différences de teneurs ou de profils dans les germes et les cotylédons, suggérant ainsi l'effet prépondérant des régulations post-traductionnelles, notamment dans la formation du complexe multienzymatique de biosynthèse de ces composés. Nous avons aussi mis en évidence une forte expression du gène CHS9 codant pour la chalcone synthase 9, avec un profil correspondant plus à l'accumulation des isoflavones dans le germe que dans les cotylédons. Les gènes CHS7 et CHS8 codant pour les chalcone synthases 7 et 8, déjà signalés comme fortement corrélés à la synthèse des isoflavones, sont plus liés à l'accumulation dans les cotylédons que dans les germes. Ces travaux montrent aussi que le gène F6H signalé dans la littérature ne s'exprime pas dans les germes. En revanche, deux candidats dont la séquence est similaire à 79% ont été étudiés. Le gène F6H3 est le seul à s'exprimer dans la graine, uniquement dans le germe. Son expression n'a pas été détectée dans les germes d'une lignée mutante qui ne produit pas de glycitéine. Ce gène est donc un candidat potentiel clef pour la synthèse de la glycitéine dans le germe. La structure particulière de l'enzyme correspondante pourrait indiquer une forte implication de l'architecture du complexe enzymatique et des contraintes qui en découlent dans l'utilisation préférentielle d'une voie ou d'une autre dans ce schéma de biosynthèse. / The soybean seed contains large amounts of isoflavones (genistein, daidzein, and glycitein). Owing to their phytoestrogenic properties, these compounds can have beneficial effects on human health, but they can also be considered as endocrine disruptors, for example in infant formulas. The isoflavone content and composition in the seed depend on the considered fraction. The cotyledons contain only genistein and daidzein, while the hypocotyls are four to ten times more concentrated and contain three isoflavones, mostly daidzein and glycitein. The genotype has a strong influence on total isoflavone content, and even more on the percentage of individual isoflavones in cotyledons and hypocotyls. The objective of this work is to investigate the genetic determinism that underlies such contrasted contents and compositions between the two seed fractions, and the relation between main biosynthetic steps and genotypic differences. First, the genes of isoflavone synthases (IFS) were sequenced in varieties with highly contrasted content and composition. The expression of different keys genes of the biosynthesis (nine chalcone synthases (CHS), a chalcone reductase (CHR), four chalcone isomerases (CHI) and the two isoflavone synthases (IFS) have then been followed by quantitative RT - PCR in the cotyledons and hypocotyls, at three critical stages of seed development (25, 40 and 60 days after flowering). Second, the expression of different candidate genes for the flavonoid 6-hydroxylase (F6H) which catalyzes the first step in the synthesis of the glycitein has been investigated. The polymorphism of the genomic sequences IFS1 and IFS2 of isoflavone synthases was not correlated with differences in isoflavone contents. The transcriptional activity of key genes of the biosynthesis of isoflavones pointed out the existence of a distinct regulation of isoflavone biosynthesis between the two seed fractions. The expression levels of target genes were not always related to differences in isoflavone content or compositions in the hypocotyls and cotyledons. This suggests the overriding effect of post-translational regulation, especially in the formation of multienzyme complex of biosynthesis of these compounds. The chalcone synthase gene CHS9 was highly expressed, with a profile similar to the accumulation of isoflavones in hypocotyls. The chalcone synthase genes CHS7 and CHS8 expressions, already reported as highly correlated to the biosynthesis of isoflavones were more related to accumulation in the cotyledons than in hypocotyls. This work has also shown that the F6H gene, reported in the literature was not expressed in the hypocotyls. However, two candidates with as highly similar coding sequence (79%) have been studied. The F6H3 gene is the only one expressed in the seed, more precisely in the hypocotyls but it was not expressed in the cotyledons. Moreover, it was not expressed in a mutant line which did not accumulate glycitein. This gene is therefore a key potential candidate for the synthesis of the glycitein in hypocotyls. The particular structure of the corresponding enzyme may indicate a strong involvement of the architecture of the multienzyme complex of isoflavones biosynthesis and the constraints arising in the preferential use of a track or another in this scheme of biosynthesis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2012INPT0065 |
| Date | 20 July 2012 |
| Creators | Artigot, Marie-Pierre |
| Contributors | Toulouse, INPT, Daydé, Jean, Berger, Monique |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French, English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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