Les amyotrophies spinales proximales sont des maladies génétiques neuromusculaires caractérisées par la dégénérescence des motoneurones spinaux et une atrophie des muscles squelettiques proximaux. La perte de fonction du gène smn1, un gène essentiel à la survie des motoneurones, entraîne une réduction drastique du niveau de protéine SMN et est, à l’origine des symptômes observés chez les patients. L'amphibien anoure Xenopus tropicalis constitue un très bon petit animal modèle pour étudier cette maladie ainsi que le développement des motoneurones. En effet une diminution de la production de la protéine SMN via l’utilisation de morpholinos a permis de montrer chez les têtards, des défauts de migration des motoneurones ainsi qu’une atrophie des muscles caudaux. Pour développer un modèle héritable de SMA, nous avons utilisé des nucléases tels que les ZFN ou le système CRISPR/Cas pour générer des mutations du gène smn chez Xenopus tropicalis. Nous avons conçu les outils moléculaires pour induire différentes mutations du gène smn avec des ZFN ou le système CRISP/Cas9. Nous avons ensuite validé l'efficacité de ces nucléases dans des embryons in vivo et développé une méthode de recherche de mutations basée sur l’utilisation des endonucléases T7EI et Surveyor. Nous avons obtenu un animal fondateur mutant qui permettra de générer des embryons homozygotes pour la mutation. En parallèle, nous avons développé une lignée transgénique chez Xenopus tropicalis permettant de visualiser les populations de motoneurones spinaux, pour mieux caractériser les animaux mutants smn in vivo. La combinaison de ces deux lignées permettra de mieux comprendre la physiopathologie motoneuronal liée à des mutations de smn. / Spinal muscular atrophy (SMA) is a neurodegenerative disease characterized by motor neuron loss and skeletal muscle atrophy. In human the loss of function of the smn1 gene, the main supplier of survival motor neuron protein (SMN), leads to reduced levels of SMN and eventually to SMA. The anuran amphibian Xenopus tropicalis is a good animal model for the study of SMA and motor neurons development. Indeed the inhibition of the production of SMN using antisense morpholinos leads to caudal muscular atrophy in tadpoles. To develop an inheritable SMA model, we edited the smn gene in X. tropicalis using zinc-finger nucleases (ZFNs) and CRISPR/Cas system. As a first step, we designed the molecular tools needed to induce mutations of the smn gene using ZFN and CRISPR/cas9. Next we probed the efficiency of these tools and developed a method to identify mutations using T7EI and Surveyor endonucleases. We obtained a mutant frog and thus we will be able to produce homozygous mutant embryos for smn. In parallel we developed a transgenic line of Xenopus tropicalis frogs in which we can image motor neurons populations in vivo. The combination of both lines should enable to increase our knowledge and understanding of motor neuron physiopathology due to smn mutations.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2014EVRY0038 |
| Date | 12 December 2014 |
| Creators | Vouillot, Léna |
| Contributors | Evry-Val d'Essonne, Pollet, Nicolas |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image |
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