La thrombine est l'enzyme principale dans le processus d'hémostase. Les dérèglements de la concentration de thrombine clinique prédisposent les patients à des complications hémorragiques ou thromboemboliques. Le suivi en temps réel de la thrombine dans le sang est donc nécessaire pour améliorer le traitement de patients en état critique. Les aptamères, qui sont de courts nucléotides monobrins semblent constituer des candidats prometteurs pour la reconnaissance moléculaire dans les biocapteurs. L'objectif de ces travaux est l'étude de différentes solutions d'intégration des aptamères dans des dispositifs de diagnostic de type "point of care" pour le suivi en continu de la thrombine dans le plasma. La cinétique d'interaction des aptamères avec la thrombine et leur spécificité vis-à-vis de la prothrombine et des inhibiteurs de la thrombine ont été étudiés par résonance par plasmons de surface. Ces travaux ont démontré la faible spécificité de l'aptamère HD1 vis-à-vis de la thrombine, et la présence d'interactions non-spécifiques avec la prothrombine, les inhibiteurs naturels de la thrombine et l'albumine. Inversement, nous avons observé une bonne affinité de l'aptamère HD22 avec la même liste de cible. Parallèlement, nous avons évalué des stratégies d'intégration d'aptamères dans des dispositifs d'analyse. Le principe de reconnaissance a ensuite été validé et la possibilité de détecter la thrombine dans des gammes de concentration de 5 à 500nM a été démontrée. Enfin, afin d'augmenter la spécificité de la détection de la thrombine, nous avons proposé une nouvelle approche basée sur l'ingénierie de structures dimères interconnectant HD1 et HD22. / Thrombin is the central enzyme in the process of hemostasis. Normally, in vivo concentration of thrombin is rigorously regulated; however, clinically impaired or unregulated thrombin generation predisposes patients either to hemorrhagic or thromboembolic complications. Monitoring thrombin in real-time is therefore needed to enable rapid and accurate determination of drug administration strategy for patients under vital threat. Aptamers, short single-stranded oligonucleotide ligands represent promising candidates as biorecognition elements for new-generation biosensors. The aim of this PhD work therefore is to investigate different solutions for the integration of thrombin-binding aptamers in point-of-care devices for continuous monitoring of thrombin in plasma. The kinetics of aptamer interaction with thrombin and specificity towards prothrombin and thrombin - inhibitor complexes was rigorously investigated using Surface Plasmon Resonance. These experiments unveiled the complex character of interaction of the HD1 with thrombin, confirming nonspecific interactions with prothrombin, natural inhibitors of thrombin, serum albumin whereas another 29-bp aptamer HD22 proved to be highly affine and specific towards thrombin. On the other hand we explored aptamer integration options. We validated the principle and at the same managed to detect different concentrations of thrombin (5-500 nM). We finally proposed a novel approach to increase sensitivity and specificity for thrombin detection based on the engineering of aptadimer structures bearing aptamers HD1and HD22 interconnected with a nucleic acid spacer.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2015TOU30050 |
| Date | 25 February 2015 |
| Creators | Trapaidze, Ana |
| Contributors | Toulouse 3, Gué, Anne-Marie |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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