Les arguments en faveur d’un rôle important de l'architecture des chromosomes en interphase pour la régulation des gènes et la maintenance du génome s’accumulent rapidement. Au cours de l'interphase, les chromosomes sont positionnés de façon non aléatoire l’un par rapport à l'autre et fournissent ainsi des points de repère nucléaires. Deux types d'interactions contribuent probablement à ce positionnement non aléatoire: (i) des domaines subchromosomiques interagissent avec des structures nucléaires telles l'enveloppe nucléaire (EN) et (ii) des interactions intrachromosomiques s’établissent entre des loci situés de façon linéairement distante en cis sur un même chromosome. Contribuant à l’expansion de ce domaine de recherche, nous avons poursuivi le développement d’une technique préalablement établie au laboratoire pour détecter des interactions protéine-protéine. Le développement de cette technique nouvelle a constitué une part de ce travail de thèse accompli sur des cellules humaines. Elle se base sur le marquage par la biotine de composants de la chromatine qui en interphase se trouvent à proximité immédiate de l’EN. Les cellules ont été traitées pour exprimer (i) la biotine ligase BirA fusionnée à l’émerine, une protéine de l’EN, conjointement avec (ii) une variante d’histone, l’histone macroH2A, en fusion avec un peptide accepteur de biotine. L'étiquette biotine déposée sur l’histone macroH2A pendant l'interphase est ensuite détectée par microscopie à fluorescence sur des cellules en mitose étalées sur lames. Les chromosomes mitotiques marqués peuvent en outre être caractérisés par des techniques plus classiques de caryotypage. Nous avons nommé cette technique «topokaryotypage» car elle peut fournir des informations d’ordre à la fois topologique et caryotypique. Son développement pas à pas a nécessité la production d'une lignée cellulaire ad hoc et une optimisation fine du protocole. Ce travail de thèse peut déboucher sur des questions biologiques explorées sur cellules uniques. A titre d’application, une analyse comparative a été réalisée par topokaryotypage sur des cellules cultivées in vitro dans diverses conditions de stress expérimentales. L’utilisation du topocaryotypage pourrait fournir des informations précieuses sur les mécanismes à la base de l’organisation et de la dynamtique des noyaux cellulaires. / Evidence is rapidly accumulating that the architecture of interphase chromosomes is important for both gene regulation and genome maintenance. During interphase, chromosomes are nonrandomly positioned with respect to each other and thus they provide nuclear landmarks. Two kinds of interactions are likely to contribute to this nonrandom positioning: (i) subchromosomal domains interact with nuclear structures such as the nuclear envelope (NE) and ii) intrachromosomal interactions take place between linearly distant loci positioned in cis on the same chromosome. As a contribution to this expanding research domain, we have built upon an existing approach previously established in the laboratory to detect protein-protein interactions. The new technique was developed in human cells as part of the present PhD research. It is based on biotin labelling of chromatin components which are in close proximity with the nuclear envelope (NE) in interphase cells. Cells were made to express (i) the biotin ligase BirA fused to the NE protein emerin together with (ii) a fusion between a biotin acceptor peptide and macroH2A, a variant core histone. The biotin label deposited on the macroH2A histone during interphase is then detected by fluorescence microscopy on mitotic cells spread on slides. The biotin-labelled mitotic chromosomes can be further characterized using more classical karyotyping techniques. We refer to this new technique as “Topokaryotyping” since it can provide both topological and karyotypic information. Its step-by-step development has required the establishment of an ad hoc cell line and a fine protocol optimization. This PhD work could pave the way for biological questions explored at a single cell level. As an illustration, a comparative topokaryotyping analysis was performed on cells cultivated in vitro in various experimental stress conditions. It is envisioned that using this technique can provide valuable mechanistic insights relevant to the organization and dynamics of cell nuclei.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2016SACLS349 |
| Date | 18 October 2016 |
| Creators | Jurisic, Anamarija |
| Contributors | Université Paris-Saclay (ComUE), Lipinski, Marc |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image, StillImage |
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