Chez Arabidopsis thaliana, deux gènes codent des enzymes de branchement (BE) BE2.2 et BE2.1 responsables de la formation des liaisons α-1,6 de l’amidon transitoire synthétisé dans la feuille de la plante. Ces enzymes, appartenant à la famille GH13_8 de la classification CAZy, agissent en clivant une liaison α-1,4 d’un glucane puis en transférant la chaîne clivée en position α-1,6 selon un mécanisme d’action qui peut être intra ou intermoléculaire. Dans ce travail, une caractérisation enzymatique et structurale des BEs d’A. thaliana (classées de type II d’après leur séquence en acides aminés) a été réalisée et les résultats comparés à ceux de la BE d’E. coli (GlgB, enzyme de type I).L'état oligomérique, la forme en solution et l’organisation structurale des BEs ont été évalués par une approche SAXS. Par des analyses spectrophotométriques, le pH, la température, mais aussi le KM pour l’amylose et l’amylopectine ont été déterminés. Une analyse sur gel de polyacrylamide, en conditions natives, a permis d’évaluer le comportement électrophorétique des BEs en présence ou en absence de ces substrats et d’en déterminer leur constante d’affinité (Ks). Notre étude révèle que les BEs d’ A. thaliana ont plus d'affinité pour l’amylopectine que pour l’amylose contrairement à GlgB. En présence d’un substrat branché, des changements d’oligomérie et/ou de la conformation des BEs d’A. thaliana ont été observés. Finalement, des analyses en chromatographie échangeuse d'anions ont permis de déterminer la taille minimale du substrat nécessaire à l’activité des BEs et la taille des chaînes transférées. Les résultats obtenus pointent vers un mécanisme d’action intramoléculaire de BE2.2. / BE2.2 and BE2.1 are the two genetically independent branching enzymes (BE) isoforms involved in transitory starch synthesis in A. thaliana and belong to family GH13_8 (according to CAZy database). Both are classified as type II BE due to their amino acid sequence. In Arabidopsis leaves, they are the only enzymes that catalyze the formation of α-1,6 branch points by cleaving α-1,4 linkages and transferring the newly formed reducing end in α-1,6 position through an intra or intermolecular mechanism. In this work, we report in vitro enzymatic characterization and structural analysis of A. thaliana BEs, these results were compared to E. coli BE enzymatic analysis (GlgB, type I enzyme).Structural analysis using SAXS approach was used to evaluate A. thaliana BEs oligomeric state, shape in solution and to determine BE organization. In vitro enzymatic analyses were performed using spectrophotometry assays to establish their catalytic parameters such as pH, temperature and also KM for amylose and amylopectin. Native PAGE analyses were also used to assess BEs behaviour in the presence or absence of substrates and to determine their affinity constant (Ks) for amylopectin and amylose. Enzymatic characterization reveals that both A. thaliana BEs have more affinity for amylopectin than for amylose, contrary to GlgB. Moreover, interaction of A. thaliana BEs with branched substrates induces protein oligomerization and/or conformational changes. Finally, determination of the minimal length of their substrate and characterization of reaction products were performed using anions exchange chromatography analyses.Taken together, our data point to an intramolecular mechanism of action of BE2.2.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2017LIL10226 |
| Date | 30 November 2017 |
| Creators | Wychowski, Adeline |
| Contributors | Lille 1, Wattebled, Fabrice, Roussel, Xavier |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French, English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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