Clostridium difficile est un bacille à gram-positif anaérobie strict et sporulant. Cet entéropathogène est responsable de diarrhées post-antibiotiques et de colites pseudomembraneuses. Après germination des spores dans le petit intestin, les cellules végétatives de C. difficile vont être soumises à de nombreux stress comme des peptides antimicrobiens, des variations d’osmolarité et de pH ainsi qu’une faible tension d’O2 à proximité des cellules épithéliales du colon. De plus, la production des toxines va favoriser une forte inflammation responsable de la production de nombreux composés oxydants tels que les espèces réactives de l’oxygène (ERO), du NO et des espèces réactives de l’azote (ERN). La présence de ces différents stress suggère que C. difficile possède des mécanismes de détection, de protection et de détoxification. Chez les firmicutes, plusieurs de ces mécanismes sont contrôlés par le facteur sigma alternatif impliqué dans la réponse générale aux stress, SigB. De manière intéressante des gènes codant SigB et ses régulateurs (RsbV et RsbW) sont présents dans le génome de C. difficile, cependant aucunes données concernant l’existence ou le rôle d’une réponse générale aux stress ne sont présentes chez cette bactérie. Nous avons dans un premier temps construit un mutant sigB et nous avons montré que cette inactivation n’entraînait pas de défaut de croissance. Via une analyse globale de l’expression des gènes, nous avons montré que SigB contrôle 20% des gènes de C. difficile à l’entrée en phase stationnaire. SigB contrôle négativement la sporulation. SigB contrôle positivement plusieurs gènes codant des protéines associées à la surface et pouvant intervenir dans le processus d’adhésion aux cellules de l’hôte. SigB joue également un rôle crucial dans l’adaptation aux stress rencontrés lors de l’infection dans le tube digestif et dans la colonisation. En effet, un mutant sigB est plus sensible aux pH légèrement acides, à certains peptides antimicrobiens, aux ERO, à différents composés générant du NO ainsi qu’aux faibles tolérances en O2. L’étude de la voie de signalisation aboutissant à l’activation de SigB a également été étudiée au cours de ce projet de thèse. Le gène sigB est le dernier gène d’un opéron constitué de CD0007 et CD0008, codant des protéines aux fonctions inconnues, ainsi que de rsbV et rsbW, codant respectivement le facteur anti-anti-sigma et le facteur anti-sigma. De manière intéressante, l’expression de sigB ne semble pas autorégulée chez C. difficile, à l’inverse des autres firmicutes. Les interactions entre RsbV et RsbW ainsi que RsbW et SigB, impliquées dans l’activation de SigB sont présentes chez C. difficile. La délétion du gène rsbV entraîne une augmentation de la sensibilité aux composés générant du NO et une diminution de la tolérance à l’O2. Ces résultats sont en accord avec la diminution de l’expression des gènes cibles de SigB chez le mutant rsbV. La phosphatase impliquée dans le processus d’activation de SigB, en déphosphorylant vraisemblablement RsbV, a également été identifiée et inactivée. La délétion du gène codant cette phosphatase, CD2685 conduit à l’augmentation de la sensibilité aux composés générant du NO ainsi qu’à la diminution de la tolérance à l’O2, en accord avec son implication dans la voie d’activation deσB. L’activité de SigB augmente suite à une carence nutritive. En effet, l’expression des gènes cibles de SigB est induite de manière dépendante de SigB et de RsZ à l’entrée en phase stationnaire ou après exposition au CCCP, un composé réduisant le niveau intracellulaire d’ATP. Ces travaux de thèse permettent d’établir un rôle prépondérant de SigB et de sa voie d’activation au cours de l’infection notamment dans la protection et la détoxification de stress majeurs que C. difficile est susceptible de rencontrer dans le tube digestif / Clostridium difficile is a tram-positive, anaerobic, spore-forcing bacterium. This enteropathogen is a major cause of antibiotic-associated diarrhea and of pseudomembranous colitis, a potentially lethal disease. After germination, vegetative cells encounter different stresses such as pH variations and hyperosmolarity as well as antimicrobial peptides. Moreover, the production of toxins triggers an important inflammation process leading to the production of several antimicrobial compounds such as reactive oxygen species (ROS), nitric oxide (NO) and reactive nitrogen species. The presence of these different stresses suggests that C. difficile has developed some mechanisms of detection, protection and detoxification. In the firmicutes, several of these mechanisms are controlled by the alternative sigma factor involved in the general stress response, SigB. Interestingly, genes encoding SigB and its regulators (RsbV and RsbW) are present in the genome of C. difficile, however less is known about the role of a general stress response in this bacterium. We constructed a sigB mutant and we showed that sigB inactivation does not lead to a growth defect. Using a transcriptomic analysis, we showed that SigB controls around 20% of the genes of C. difficile at the onset of the stationary phase. SigB negatively controls the sporulation process. SigB positively controls several genes encoding surface associated proteins likely involved in the adhesion to the host cells. SigB plays a crucial role in the stress management including several stresses C. difficile likely encounter during its infectious cycle. Indeed, the sigB mutant is more sentsitive to low pH, to some antimicrobial compounds, to ROS, to several NO-donor compounds as well as to low oxygen tension. The signaling pathway involved in the activation of SigB has been studied in the PhD project. The sigB gene is the last gene of an operon in which belong CD0007 and CD0008, encoding town unknown function proteins, as well as rsbV and rsbW, encoding the anti-anti-sigma factor and the anti-sigma factor of SigB, respectively. Interestingly, contrary to the other firmicutes, the expression of sigB does not seem to be auto-regulated. Protein interactions between RsbV and RsbW as well as RsbW and SigB, involved in the activation of SigB, are present in C. difficile. The disruption of rsbV leads to a higher sensitivity to NO-donor compounds as well as low oxygen tension. These results are in agreement with the decreased expression of several SigB target genes in the rsbV mutant. The phosphatase involved in the activation of SigB, likely by dephosphorylating RsbV, has been identified and disrupted. The disruption of CD2685, encoding this phosphatase, leads to a higher sensitivity to NO-donor compounds as well as a lower tolerance to low oxygen tension, in agreement with its involvement in the SigB activation pathway. The activity of SigB increased after an energetic starvation. Indeed, the expression of SigB target genes are increased in a SigB and CD2685 dependent manner at the onset of the stationary phase or after CCCP exposure, a compound decreasing the intracellular level of ATP. This work allows to show a crucial role of SigB and its activation pathway during the infection notably in the protection and the detoxification of the major stresses C. difficile is likely to encounter in the gut
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2017USPCC120 |
| Date | 28 September 2017 |
| Creators | Kint, Nicolas |
| Contributors | Sorbonne Paris Cité, Martin-Verstraete, Isabelle |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image |
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