La différentiation des lymphocytes Th17 dépend fortement du facteur de transcription RORγt. RORγt a été identifié pour la première fois chez la souris comme un facteur spécifique des thymocytes, jouant un rôle important dans le développement du thymus. En effet, RORγt est exprimé sélectivement dans le stade double positif (DP) et il est ensuite réprimé dans le stade simple positif (SP) ainsi que dans les cellules CD4+ naïves périphériques. Les mécanismes moléculaires qui régulent l’expression transitoire de RORγt dans le thymus et en périphérie sont peu connus. Le but de ce projet est de définir les paramètres transcriptionnels et épigénétiques en corrélation avec l'expression de RORγt chez l’homme. Afin de caractériser les mécanismes moléculaires qui contrôlent l'expression de RORγt dans les thymocytes humains, nous avons effectué une analyse des modifications épigénétiques sur l’ensemble du locus RORC. Nos résultats montrent que le locus RORC subit un remodelage étendu, qui lui confère une conformation "permissive" lors de la transition du stade Double Négatif (DN) au stade DP (augmentation de H4ac et diminution de H3K27me3). Alors que, H3K4me3, qui est un marqueur de promoteurs actifs, est présente spécifiquement au niveau du promoteur RORC2, et uniquement dans les cellules qui expriment RORC2. Une analyse similaire des marqueurs épigénétiques pour les enhancers (H3K27ac) nous a permis d'identifier plusieurs régions avec une fonction potentiellement régulatrices de l'expression de RORC2. Nous avons démontré que certaines de ces régions avaient une fonction d'enhancer in vitro. Dans les cellules T humaines CD4+ naïves périphériques, nous avons observé que la stimulation du TCR en présence de TGFβ est suffisante pour induire RORγt et un remodelage du locus RORC. Nous avons également constaté que la cyclosporine A, un inhibiteur de la voie calcineurine/NFAT, inhibe fortement l'expression de RORC2. Cette inhibition est associée ˆ une diminution des marqueurs positifs de la chromatine. De plus, nous avons démontré que l’activation des cellules induit une activation de NFAT et sa liaison au promoteur RORC2 et aux enhancers. Cette liaison coïncide avec le recrutement de p300/CBP au promoteur qui est dépendant de la calcineurine, ce qui peut permettre le recrutement d'autres facteurs (tel que NFkB) importants pour la différenciation des Th17. Nous avons Également détecté la liaison de NFAT au locus RORC dans les thymocytes. Ces données démontrent un rôle central de NFAT dans la régulation Epigénétique et transcriptionnelle du locus RORC / Generation of inflammatory CD4+ Th17 cells is strongly dependent on the transcription factor retinoid-related orphan receptor, RORγt. RORγt was first identified in the mouse as a thymocyte-specific factor and was shown to play a critical role in the regulation of thymopoiesis. In the thymus RORγt is selectively expressed at the double positive stage (DP: CD4+ CD8+), and is down regulated in later stages of thymocyte development, as well as in naïve peripheral CD4+ T cells. The molecular mechanisms by which RORγt is transiently expressed during thymopoiesis and re-expressed in selected peripheral lymphocytes are poorly understood. The goal of this project is to define the transcriptional and epigenetic settings that correlate with RORγt expression. To start addressing the molecular mechanisms that control expression of human RORγt in thymocytes, we performed an analysis of epigenetic modifications at the RORC locus. Our findings show that the whole RORC locus undergoes extensive remodeling, assuming a more "permissive" conformation at the transition between the Double Negative and the DP stage (increase of H4ac and decrease of H3K27me3). However, H3K4me3, a mark of active promoters, is present specifically at the RORC2 promoter only at stages where RORC2 is expressed. A similar analysis of epigenetic marks for enhancers (H3K27ac) has allowed us to identify several regions with potential regulatory function on RORC2 expression, which displayed enhancer function in vitro. In human naïve peripheral CD4+ T cells we observed that TCR stimulation in the presence of TGFβ is sufficient to induce low levels of RORγt expression, and further remodeling of the RORC locus. We also found that cyclosporine A, an inhibitor of the calcineurin/NFAT pathway, strongly inhibited RORC2 expression, and was associated with a decrease in the positive chromatin marks at the RORC locus. Consistently, we demonstrated that cell stimulation induced NFAT activation, and binding to the RORC2 promoter and enhancers. This binding coincided with calcineurin-dependent p300/CBP recruitment and remodeling of the locus, which may allow binding of the transcriptional machinery and other factors (such as NFkB) important for Th17 differentiation. NFAT binding to the RORC locus could be also detected in thymocytes. These data demonstrate a central role for the NFAT pathway in the epigenetic priming the RORC locus for transcriptional competence.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2017USPCC289 |
| Date | 03 October 2017 |
| Creators | Yahia, Hanane |
| Contributors | Sorbonne Paris Cité, Bianchi, Elisabetta |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image |
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