La spectrométrie de masse est une technique analytique permettant de mesurer le ratio
masse sur charge d’un ion. Cette technique, très répandue en chimie analytique permet
d’élucider la composition moléculaire de mélanges complexes à partir de systèmes
homogénéisés. De ce fait, toute l’information sur la distribution spatiale des molécules est
perdue. L’imagerie par spectrométrie de masse (IMS) a été inventée afin de résoudre ce
problème et permettre d’élucider la distribution spatiale de molécules cibles sur des sections
tissulaires minces provenant de tissus biologiques tels que de mammifères ou de plantes. L’un
des grands avantages de l’IMS est sa complémentarité à l’histopathologie, technique
permettant de révéler la structure ainsi que la localisation de certaines biomolécules à partir de
sections tissulaires minces. Cependant, cette dernière se limite principalement aux protéines et
aux molécules pouvant avoir une interaction spécifique avec un anticorps. L’IMS permet la
détection d’une vaste gamme de biomolécules allant des petits métabolites aux polymères de
haut poids moléculaire. Parmi les biomolécules détectables par IMS, les lipides attirent de plus
en plus l’attention des analystes. En effet, ils occupent différentes fonctions clés au sein des
systèmes biologiques, autant structurales que métaboliques, comme constituants des parois
cellulaires, acteurs de la signalisation cellulaires ainsi que dans le stockage d’énergie. Leur
intérêt est d’autant plus important qu’aucune technique histologique classique ne permet
actuellement de détecter de façon spécifique les différentes classes de lipides.
De façon générale, l’IMS de lipides est effectuée en utilisant la désorption-ionisation
laser assistée par matrice (MALDI). Ce procédé permet de révéler l’emplacement de
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différentes classes de molécules en exploitant l’affinité que ces dernières ont pour une matrice
particulière. Au-delà du choix de la matrice, d’autres paramètres tels que le mode de
déposition de la matrice, le choix des solvants ainsi que le type de lavage utilisé vont
également affecter le type de molécules détectés lors d’une analyse MALDI. Malgré les très
bonnes performances du MALDI pour l’analyse de lipides, ce mode d’analyse se limite
souvent aux lipides polaires facilement ionisables. Les lipides neutres comme le cholestérol
(CHO) et les triacylglycérols (TAGs) sont impliqués à différents niveaux de fonctions
biologiques fondamentales. Ainsi, nous avons développé trois stratégies permettant l’analyse
de ces lipides neutres et de faibles abondances comme les gangliosides, directement à partir de
sections tissulaires minces par MALDI ainsi que par désorption-ionisation laser classique
(LDI).
L’implication du cholestérol en tant que molécule structurale et précurseur de la
synthèse de diverses hormones et vitamines, en fait une cible de choix pour l’analyse par IMS.
Historiquement, l’analyse du cholestérol par MALDI permettait de le détecter sous sa forme
déshydratée. De ce fait, il était impossible de le distinguer des autres métabolites tels que ses
esters qui produisaient le même fragment. Afin de permettre l’IMS du cholestérol intact nous
avons développé une nouvelle technique de préparation d’échantillons reposant sur le dépôt
d’une couche nanométrique d’argent (16±2 nm) sur une section tissulaire mince par
pulvérisation. Cette technique permet d’ioniser spécifiquement le cholestérol intact ainsi que
divers acides gras sous forme d’adduits d’argent, et ce, avec une haute résolution spatiale (5
µm).
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Au-delà du cholestérol et des acides gras, une autre classe de lipides neutres très
abondants, les triglycérides, reste difficilement analysable par MALDI IMS. En effet, les
TAGs constituent la principale classe de lipides impliqués dans le stockage énergétique au
niveau cellulaire. Ce rôle comme source d’énergie fait des TAGs un acteur incontournable de
plusieurs maladies métaboliques telles que la stéatose hépatique, l’athérosclérose ainsi que la
maladie d’Alzheimer. La difficulté d’analyser les TAGs par IMS provient de leur fragilité en
milieu acide ainsi que de leur faible tendance à former des adduits sodium nécessaire à leurs
analyses. En considérant ces limites, nous avons développé une méthodologie de préparation
d’échantillon en deux étapes permettant l’analyse hautement spécifique des TAGs par LDI
IMS. Dans un premier temps, les sections tissulaires minces sont initialement exposées à une
solution aqueuse contenant un tampon carbonate à base de sodium (pH 10.3, 85 mM) ainsi que
d’acétate de sodium (250 mM) afin de facilité la formation d’adduit sodium et de limiter la
fragmentation des TAGs en source. Par la suite, une couche nanométrique d’or (28±3 nm) est
déposée sur la section afin de permettre l’analyse des TAGs par IMS à haute résolution
spatiale (> 10 µm). Lorsque ces derniers ont une abondance réduite dans les sections
tissulaires, cette méthode permet aussi l’analyse d’esters de cholestérol (CE).
La maladie de Hunter est une maladie génétique caractérisée par l’accumulation de
glycosaminoglycanes (GAGs) ainsi que de l’accumulation secondaire de gangliosides. Ce
phénomène est dû à l’absence de l’enzyme iduronate-2-sulfatase (IdS) qui permet la
dégradation des GAGs. L’accumulation des GAGs et des gangliosides a pour conséquence
l’apparition de problèmes fonctionnels et neurologiques majeurs entrainant la mort. Il existe
une thérapie de remplacement enzymatique où une forme recombinante de l’enzyme IdS est
injectée aux patients. Cette thérapie permet de rétablir le métabolisme normal des GAGs et
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gangliosides dans tous les organes sauf le cerveau où la barrière hémato-encéphalique
empêche l’IdS recombinante d’atteindre les zones affectées. L’étude de la composition
moléculaire des dépôts de GAGs et gangliosides au niveau cérébral constitue un défi important
afin de comprendre la progression des troubles neurologiques engendrés par cette
accumulation. À cette fin, nous avons développé une méthode MALDI spécifique à l’analyse
des gangliosides à partir de sections tissulaires minces de cerveau de souris simulant la
maladie Hunter (IdS-KO). Cette méthode d’analyse par MALDI IMS permet une révélation
immuno-histochimique (IHC) des dépôts suivant l’analyse IMS. Nous avons pu visualiser cinq
types de gangliosides dont quatre spécifiques au dépôt présent dans les cerveaux révélés par
IHC sur la même section tissulaire. Cette étude nous a permis de distinguer pour la première
fois des GM3 et GM2 selon la composition de leur chaine latérale et non de leur chaine
polysaccharidique révélée par l’analyse IHC. / Mass spectrometry (MS) is an analytical technique that measures the mass-to-charge
ratio of ions. This technique is widely used in analytical chemistry to solve the molecular
composition of complex homogenized samples. The use of homogenized samples means that
all the information with respect to the initial distribution of analytes is lost. Imaging mass
spectrometry (IMS) is an MS technique which is able to provide the spatial localization of a
given analyte on a surface, such as thin tissue sections from various animal sources. One of the
greatest advantages of IMS is its complementarity with histopathology which normally reveals
the general structure of thin tissue sections as well as the localization of certain biomolecules
such as proteins or of any molecules capable of specific interactions with an antibody. On the
other hand, IMS is capable of imaging a wide variety of biomolecules ranging from small
metabolites to the high molecular weight proteins and polymers. Among these, lipids are of
particular interest for their key involvements in many biological processes. Their interest is
even greater when considering that lipid imaging by classical histology is unable to
differentiate between all lipid species.
IMS of lipids is typically performed using matrix assisted laser desorption/ionization
(MALDI). MALDI IMS can differentiate various classes of lipids and their localization within
a thin tissue section by taking advantage of the specific affinity that different classes of lipids
have for different matrices. The matrix deposition process, along with the choice of solvents,
are key parameters that need to be considered in MALDI IMS. While MALDI offers great
coverage of the phospholipidome, it fails miserably for neutral lipid analysis. Indeed,
cholesterol and triacylglycerols (TAGs) are two classes of neutral lipids with very important
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biological roles which are extremely difficult to image by MALDI. We have developed three
new strategies that enables the detection of neutral lipids, some of which are expressed in low
abundance such as gangliosides, directly from thin tissue section using either MALDI or laser
desorption/ionization (LDI).
Cholesterol is a precursor of many key biomolecules such as vitamins and hormones.
It’s also a major component of the cellular membrane. MALDI IMS allows in some cases
imaging of the dehydrated form of cholesterol. Unfortunately, detecting cholesterol as such
makes it impossible to distinguish some of its metabolites which ionize in a similar fashion
and dissociate to produce the same ions. To address this issue, we have developed a new
sample preparation method involving the deposition of a nanometer scale silver layer (16±2
nm) over a thin tissue section. This enables the detection by LDI MS of intact cholesterol and
some fatty acid species as silver adducts with up to 5 µm in spatial resolution.
Beyond cholesterol and fatty acids, TAGs is another class of highly abundant neutral
lipids still poorly detected by MALDI IMS. As TAGs are the main molecules involved in
energy storage of cells, they have been implicated in many metabolic diseases such as non-
alcoholic fatty liver disease, atherosclerosis and even Alzheimer’s disease. The reason why
TAGs are poorly detected by MALDI comes from two key factors. First, TAGs are unstable in
acidic environments, typical of MALDI matrices. Second, competition effects for the ionizing
proton provided by the MALDI matrix prevent TAGs from easily ionizing through this main
ionization process. To overcome these limitations, we have developed a new two-step sample
preparation method for TAG LDI IMS. We initially deposited a solution of carbonate buffer
(pH 10.3, 85 mM) and sodium acetate (250 mM) on the tissue section to increase the amount
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of available sodium for enhanced TAG ionization. The second step consisted of sputtering a
nanometer scale UV absorbing gold layer (28±3 nm) that allows for the detection of TAGs by
LDI IMS with spatial resolution as low as 10 µm. When TAGs are present in low amounts in
the tissue section, this method also enables the detection of cholesterol esters.
Hunter’s disease is a genetic disease characterized by the abnormal accumulation of
glucoaminoglycans (GAGs) and the secondary accumulation of gangliosides due to the lack of
iduronate-2-sulfatase (IdS) enzyme which controls their degradation. The accumulation of
both GAGs and gangliosides form deposits which induces various functional issues to
different organs as well as neurologic disorders. To minimize these effects, an enzyme
replacement therapy has been developed. Unfortunately, it shows efficacy in all organs except
the brain due to the inability of the recombinant enzyme to cross the blood-brain barrier. To
further our knowledge of the progression of the disease, using a mouse model of Hunter’s
disease we have developed a MALDI based method to specifically image gangliosides in brain
deposits with a spatial resolution of 5 µm. This method also permits subsequent ganglioside
staining by immunohistochemtry of the tissue section. With this method, we have identified
four types of ganglioside which are specific to the Hunter’s disease pathology. We were also
able to detect two types of deposits, one which is enriched in short chain gangliosides and the
other in long chain gangliosides.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/18432 |
| Date | 09 1900 |
| Creators | Dufresne, Martin |
| Contributors | Chaurand, Pierre |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | fra |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse ou mémoire / Thesis or Dissertation |
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