La voie de signalisation RAS-ERK régule la prolifération et la différenciation cellulaire par la propagation séquentielle d’un signal jusqu’au noyau, aboutissant à la régulation des gènes cibles. Après réception d’un stimulus extracellulaire conduisant à l’activation de la petite GTPase RAS (Rat Sarcoma), la transduction du signal s’effectue par les phosphorylations successives de RAF (Rapid Accelerated Fibrosarcoma), MEK (MAPK/ERK Kinase 1/2) et ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase 1/2).
Chez les mammifères, la famille élargie des protéines RAF comprend les trois kinases ARAF, BRAF, CRAF et les pseudokinases KSR1, KSR2 pour Kinase Suppressor of Ras 1/2. En l’absence de stimuli, les kinases RAF adoptent une forme auto-inhibée où leur région régulatrice N-terminale (N-terminal Region ou NTR) inhibe l’activité catalytique de leur domaine kinase (Kinase Domain ou KD). L’activation des GTPases RAS ancre les kinases RAF à la membrane plasmique via le domaine RBD (Ras Binding Domain) de leur NTR. Ce phénomène favorise la dérépression des KD et dévoile leur interface de dimérisation. L’association de deux protéines RAF l’une avec l’autre induit l’activation des kinases RAF et la phosphorylation de leur substrat MEK. Bien que dénuées d’activité kinase intrinsèque, les pseudokinases KSR sont néanmoins capables de dimériser avec les kinases RAF et de les activer.
Des mutations des protéines clés de la voie RAS-ERK conduisent à son activation anormale et sont directement responsables du développement et de la progression tumorale. Notamment, la kinase BRAF est altérée dans 7 % des cancers. L’échec des stratégies thérapeutiques permettant d’inhiber les kinases RAF a mis en lumière l’importance de la dimérisation dans la régulation de leur activité. Ainsi, les processus favorisant la formation d’hétérodimères RAF/KSR ne sont, à ce jour, pas bien compris.
La problématique de la thèse a été d’identifier les mécanismes moléculaires régissant la formation spécifique du dimère BRAF/KSR1 aboutissant à la phosphorylation du substrat MEK1. Les objectifs de la thèse ont donc été 1) de déterminer ce qui permet au substrat MEK1 de se lier aux différentes protéines de la famille RAF, 2) d’identifier les domaines nécessaires à l’interaction spécifique de BRAF et KSR1, 3) de développer des stratégies de purification du dimère BRAF/KSR1 pour en faire une analyse structurale. Ce travail a dans un premier temps montré que le substrat MEK1 est l’activateur de sa propre kinase BRAF, en favorisant sa transactivation par KSR1 via des interactions au niveau des domaines kinases. De manière inattendue, nous avons par la suite établi que ce sont les NTR des protéines BRAF et KSR1 qui guident leur hétérodimérisation. Le dimère BRAF/KSR1 repose ainsi sur l’interaction directe du domaine BRS de BRAF et du domaine CC-SAM de KSR1. Nous avons montré que le domaine CRD de BRAF exerce une influence sur l’interaction BRS/CC-SAM et par extension, sur la dimerisation de BRAF avec KSR1. Enfin, nous avons testé plusieurs stratégies de purification du dimère BRAF/KSR1 qui nous ont permis d’optimiser une technique de purification à partir de cellules de mammifères et de générer des constructions pour des cellules d’insectes.
Ainsi, ce travail nous a permis d’améliorer la compréhension des mécanismes de formation de l’hétérodimère BRAF/KSR1 et son lien avec le substrat MEK1. Nous avons découvert des nouveaux moyens de régulation de la signalisation RAS-ERK. À terme, les résultats obtenus s’avèreront utiles pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces pour inhiber la voie RAS-ERK dans des contextes pathologiques. / The RAS-ERK signaling pathway regulates cell proliferation and differentiation by signal propagation from the cell surface to the nucleus, resulting in the regulation of targeted genes. After receiving an extracellular stimulus leading to the activation of the small GTPase RAS (Rat Sarcoma), signal transduction is mediated by the successive phosphorylations of RAF (Rapid Accelerated Fibrosarcoma), MEK (MAPK/ERK Kinase 1/2) and ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase 1/2) kinases.
In mammals, the extended family of RAF proteins is comprised of the three kinases ARAF, BRAF, CRAF and the two pseudokinases KSR1, KSR2 from Kinase Suppressor of Ras 1/2. In the absence of a stimulus, RAF kinases are in an auto-inhibited conformation wherein their N-terminal regulatory region (NTR) inhibits the catalytic activity of their kinase domain (KD). Activation of the RAS GTPases anchors RAF kinases to the plasma membrane through binding of the RBD (Ras Binding Domain), present in their NTR. This phenomenon induces the release of the KDs and unveils their dimerization interfaces. The association of two RAF proteins with each other stimulates the activation of RAF kinases and the phosphorylation of their substrate MEK. Although lacking an intrinsic kinase activity, KSR pseudokinases are nevertheless able to stimulate RAF kinase activity through dimerization and transactivation.
Mutations of core members of the RAS-ERK pathway led to its abnormal activation and are directly responsible for tumor development and progression. In particular, the BRAF isoform is mutated in 7 % of cancers. Unsuccessful therapeutic strategies developed to inhibit RAF kinases have highlighted the importance of dimerization in the regulation of the catalytic activity of RAF kinases. Moreover, the process favoring the formation of RAF/KSR heterodimers is not fully understood.
The focus of this Ph.D. was to identify the molecular mechanisms governing the specific formation of the BRAF/KSR1 dimer leading to the phosphorylation of the MEK1 substrate. Our main objectives were therefore to 1) determine what allows the substrate MEK1 to bind to the different members of the RAF family of proteins, 2) identify the domains necessary for the specific interaction of BRAF and KSR1 3) develop a new approach to purify the BRAF/KSR1 dimer for structural analysis.
This work showed that the substrate MEK1 stimulates the activation of its own kinase, by promoting BRAF transactivation by KSR1 through interactions at the kinase domain level. Unexpectedly, we subsequently established that the NTRs of BRAF and KSR1 guide their heterodimerization. BRAF/KSR1 dimer formation is thus based on direct interaction of the BRS domain of BRAF and the CC-SAM domain of KSR1. We then showed that the CRD domain of BRAF has an influence on the BRS/CC-SAM interaction which overall modulates the dimerization of BRAF with KSR1. Finally, we tested several BRAF/KSR1 dimer purification strategies that allowed us to optimize a purification technique from mammalian cells. We also generated constructs enhanced for insect cells expression in the hope of successfully stabilizing BRAF/KSR1 in a signaling complex. Thus, this work allowed us to improve the understanding of the mechanisms underlying the formation of BRAF/KSR1 heterodimer and its link with its MEK1 substrate. We have discovered new ways of regulating the RAS-ERK signaling pathway. Ultimately, theses results will prove useful for the development of new effective therapeutic strategies to inhibit the RAS-ERK pathway in pathological contexts.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/28574 |
| Date | 08 1900 |
| Creators | Marullo, Sara |
| Contributors | Therrien, Marc |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | fra |
| Detected Language | French |
| Type | thesis, thèse |
| Format | application/pdf |
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