The limited intrinsic self-healing capability of articular cartilage requires treatment of
cartilage defects. Material assisted and cell based therapies are in clinical practice but
tend to result in formation of mechanical inferior fibro-cartilage in long term follow up. If
a lesion has not been properly restored degenerative diseases are diagnosed as late sequela
causing pain and loss in morbidity. Complex three dimensional tissue models mimicking
physiological situation allow investigation of cartilage metabolism and mechanisms involved
in repair. A standardized and reproducible model cultured under controllable conditions
ex vivo to maintain tissue properties is of relevance for comparable studies.
Topic of this thesis was the establishment of an cartilage defect model that allows for
testing novel biomaterials and investigate the effect of defined defect depths on formation
of repair tissue.
In part I an ex vivo osteochondral defect model was established based on isolation of
porcine osteochondral explants (OCE) from medial condyles, 8 mm in diameter and 5 mm
in height. Full thickness cartilage defects with 1 mm to 4 mm in diameter were created
to define ex vivo cartilage critical size after 28 days culture with custom developed static
culture device. In part II of this thesis hydrogel materials, namely collagen I isolated from
rat tail, commercially available fibrin glue, matrix-metalloproteinase clevable poly(ethylene
glycol) polymerized with heparin (starPEGh), methacrylated poly(N-(2-hydroxypropyl)
methacrylamide mono-dilactate-poly(ethylene glycol) triblock copolymer/methacrylated
hyaluronic acid (MP/HA), thiol functionalized HA/allyl functionalized poly(glycidol)
(P(AGE/G)-HA-SH), were tested cell free and chondrocyte loaded (20 mio/ml) as implant
in 4 mm cartilage defects to investigate cartilage regeneration. Reproducible chondral
defects, 8 mm in diameter and 1 mm in height, were generated with an artificial tissue
cutter (ARTcut®) to investigate effect of defect depth on defect regeneration in part III.
In all approaches OCE were analyzed by Safranin-O staining to visualize proteoglycans
in cartilage and/or hydrogels. Immuno-histological and -fluorescent stainings (aggrecan,
collagen II, VI and X, proCollagen I, SOX9, RUNX2), gene expression analysis (aggrecan,
collagen II and X, SOX9, RUNX2) of chondrocyte loaded hydrogels (part II) and proteoglycan
and DNA content (Part I & II) were performed for detailed analysis of cartilage
regeneration.
Part I: The development of custom made static culture device, consisting of inserts in which OCE is fixed and deep well plate, allowed tissue specific media supply without
supplementation of TGF � . Critical size diameter was defined to be 4 mm.
Part II: Biomaterials revealed differences in cartilage regeneration. Collagen I and fibrin
glue showed presence of cells migrated from OCE into cell free hydrogels with indication
of fibrous tissue formation by presence of proCollagen I. In chondrocyte loaded study
cartilage matrix proteins aggrecan, collagen II and VI and transcription factor SOX9 were
detected after ex vivo culture throughout the two natural hydrogels collagen I and fibrin
glue whereas markers were localized in pericellular matrix in starPEGh. Weak stainings resulted
for MP/HA and P(AGE/G)-HA-SH in some cell clusters. Gene expression data and
proteoglycan quantification supported histological findings with tendency of hypertrophy
indicated by upregulation of collagen X and RunX2 in MP/HA and P(AGE/G)-HA-SH.
Part III: In life-dead stainings recruitment of cells from OCE into empty or cell free
collagen I treated chondral defects was seen.
Separated and tissue specific media supply is critical to maintain ECM composition in
cartilage. Presence of OCE stimulates cartilage matrix synthesis in chondrocyte loaded
collagen I hydrogel and reduces hypertrophy compared to free swelling conditions and
pellet cultures. Differences in cartilage repair tissue formation resulted in preference of
natural derived polymers compared to synthetic based materials. The ex vivo cartilage
defect model represents a platform for testing novel hydrogels as cartilage materials, but
also to investigate the effect of cell seeding densities, cell gradients, cell co-cultures on
defect regeneration dependent on defect depth. The separated media compartments allow
for systematic analysis of pharmaceutics, media components or inflammatory cytokines on
bone and cartilage metabolism and matrix stability. / Aufgrund der geringen Selbsheilungsfähigkeit von artikulären Knorpel erfordern Knorpeldefekte
eine orthopädische Behandlung. Bislang konnte mit material- oder zellbasierenden
Behandlungsstrategien keine funktionelle Regeneration von Knorpeldefekten erreicht werden.
In Langzeitstudien zeigt sich vermehrt die Bildung von mechanisch instabilem fibrosen
Knorpel. Als Spätfolge nicht vollständig verheilter Knorpeldefekte wird die degenerative
Erkrankung Osteoarthrose diagnostiziert. 3-dimensionale Gewebemodelle, die die
physiologischen Gegebenheiten nachahmen erlauben einen Einblick in die Mechanismen
während der Defektheilung. Dem subchondralen Knochen kommt eine kritische Rolle in der
Regeneration nach Mikrofrakturierung zu, weshalb ein Knorpelmodell auf osteochondralen
Gewebe basieren sollte.
Thema der Arbeit war es ein standardisiertes Knorpeldefektmodell zu etablieren, das die
Testung neuer Hydrogelformulierungen sowohl zellfrei als auch zellbeladen hinsichtlich
deren Regenerationspotential ermöglicht und den Einfluss der Knorpeldefekttiefe auf die
Regeneration zu analysieren.
Teil I der Arbeit umfasste die Etablierung des ex vivo osteochondralen Defektmodells,
basierend auf der Isolation von porcinen osteochondralen Explantaten (OCE) mit eine
Durchmesser von 8 mm und einer Höhe von 5 mm aus der medialen Kondyle. Full
thickness Knorpeldefekte mit einem Durchmesser zwischen 1 mm und 4 mm wurden
induziert, um den kritischen Defektdurchmesser nach 28 Tagen Kultur in einer neuartigen
statischen Kulturplatte zu definieren. In Teil II stand die Testung von Hydrogelen aus
Kollagen I isoliert aus Rattenschwänzen, kommerziell erhältlicher Firbrinkleber, Matrix-
Metalloproteinase clevable poly(Ethylen Glycol) polymerisiert mit Heparin (starPEGh),
methacrylates poly(N-(2-hydroxypropyl) methacrylamid mono-dilactate-poly(Ethylene Glycol)
triblock copolymer/methacrylated Hyaluronsäure (MP/HA), thiol functionalisiertes
HA/allyl functionalisiertes poly(Glycidol) (P(AGE/G)-HA-SH) als zellfreies oder mit
20 Mio/ml Chondrozyten beladenes Implantat im Knorpeldefekt mit einem Durchmesser
von 4 mm im Fokus. Ein automatisiertes Verfahren zur Wundsetzung (ARTcut®) erlaubte
in Teil III der Thesis das Kreieren von reproduzierbaren chondralen Defekten mit 4 mm
Durchmesser und 1 mm Tiefe in das OCE Modell , um den Einfluss der Defekttiefe auf
die Knorpelregeneration zu analysieren.
Das Knorpelgewebe des OCE und/oder Hydrogele wurde in allen Experimenten mittels
Safranin-O auf Proteoglykangehalt untersucht. Immunhistologische und -fluoreszenzfärbung knorpelspezifischer Marker, Genexpressionsanalysen der Chondrozyten beladenen Hydrogele
(Teil II) und Quantifizierung der Proteoglykane und des DNA Gehalts (Teil I & II)
folgten nach ex vivo Kultur.
Teil I: Die neu entwickelten statischen Kulturkammern setzen sich aus Inserts, in denen das
OCE fixiert ist, und einer 6 Well–Platte zusammen. Dadurch wird eine Gewebespezifische
Medienversorung mit Knorpelmedium ohne TGF � in den Inserts und Knochenmedium
in der Vertiefung der Wellplatte ermöglicht. Die kritische Defektgröße im ex vivo Modell
wurde mit 4 mm festgesetzt. Teil II: Biomaterialien als Implantate im Knorpeldefekt
zeigten ein materialabhängiges Regenerationspotential. Die Einwanderung von Zellen aus
dem OCE in zellfreie Hydrogele resultierte in der Lebend-Tot Färbung bei Kollagen I
und Fibrinkleber mit der Tendenz der Synthese von fibrösem Knorpel. Die Chondorzyten
beladenen Hydrogele aus Kollagen I und Fibrinkleber zeigten eine homogene Positivfärbung
für die hyalinen Proteine Aggrekan, Collagen II und X und des Knorpeltranskriptionsfaktors
SOX9, wohingegen die Färbung bei starPEGh lokal in der perizellulären Region
lokalisiert war. Die weiteren Materialien MP/HA und P(AGE/G)-HA-SH wiesen eine
schwache Positivfärbung an einzelnen Zellclustern auf. Die Genexpressionsanalyse und
die Quantifizeirung der Proteoglykane bestätigten die histologischen Ergebnisse mit der
Tendenz der Hypertrophie, belegt durch Hochregulierung von Kollagen X und RunX2, bei
Chondrozyten eingebettet in MP/HA und P(AGE/G)-HA-SH. Teil III: In der Lebend-Tot
Färbung konnte die Einwanderung von Zellen aus dem Knorpel des OCE in den Leerdefekt
und zellfreies Kollagen I Hydrogel nachgewisen werden.
Separierte und Gewebe spezifische Medienversorgung erwieß sich als kritischer Faktor
zur Aufrechterhaltung der Knorpel ECM. Die Anwesenheit des OCE stimuliert Knorpelmatrixsynthese,
die für das in vitro kultivierte Chondrozyten beladene Kollagen I
nachweislich geringer vorhanden war. Außerdem war die Produktion des hypertrophen
Markers Kollagen X im Implantat im OCE weniger stark ausgeprägt als in der in vitro Kultur.
Die Unterschiede der Knorpelregeneration deutet auf die Bevorzugung von natürlichen
Polymeren gegenüber den synthetisch basierten Hydrogelen hin. Das ex vivo Knorpeldefektmodell
stellt eine Platform zur Testung neuer Hydrogelmaterialien als Knorpelimplantate
dar. Weiterhin kann das Modell zur Analyse von Zellbesiedelungsstrategien als auch
für Zell-Ko-Kulturen im Hinblick auf die Defektregeneration herangezogen werden. Die
getrennten Medienreservoire ermöglichen weiterhin die systematische Analyse von Medienkomponenten
oder entzündlichen Zytokinen auf die Vitalität und Stabilität von Knochen
und Knorpelgewebe.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:15561 |
| Date | January 2017 |
| Creators | Schwab, Andrea |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/doku/lic_ohne_pod.php, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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