Despite the large number of G protein-coupled receptors (GPCRs) expressed in the central nervous system (CNS), little is known about their location, organization, and dynamics in functional nanodomains at synapses. Class C GPCRs including metabotropic glutamate receptors (mGluRs) and the γ-aminobutyric acid subtype B receptor (GABABR) mediate several key functions in synaptic transmission. However, it is still insufficiently understood how these receptors function at synapses to modulate neurotransmission. One limitation is the availability of techniques to examine receptors with high spatiotemporal resolution in physiologically relevant cells. To investigate the distribution and spatiotemporal dynamics of mGluR4 and GABABR in cerebellar slices and cultured hippocampal neurons, I used advanced imaging techniques, including single-molecule imaging and superresolution microscopy with high spatial (10-20 nm) and temporal (20 ms) resolution.
The presynaptic active zone (AZ) is a highly organized structure that specializes in neurotransmitter release. mGluR4 is a prototypical presynaptic class C GPCR. mGluR4 mediates an inhibitory effect on presynaptic glutamate release mainly via the inhibition of P/Q type voltage dependent calcium channels (CaV2.1). In this study, I analyzed the organization of mGluR4 at the synapse between parallel fibers and Purkinje cells in the mouse cerebellum with near-molecular resolution using two-color direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM). Quantitative analyses revealed a four-fold mGluR4 enrichment at parallel fiber AZs. I found that an AZ contains 29 mGluR4 nanoclusters on average. Each nanocluster contains one or two mGluR4s, with few nanoclusters containing three or more receptors. To assess the spatial distribution of mGluR4 relative to functional active zone elements such as CaV2.1 and Munc 18-1 (an essential component of the synaptic secretory machinery), a distance-based colocalization analysis was used. The analysis revealed positive correlation between mGluR4 and both proteins at a distance of 40 nm. Interestingly, mGluR4 showed a higher positive correlation to Munc 18-1 in comparison to CaV2.1. These results suggest that mGluR4 might directly inhibit the exocytotic machinery to reduce glutamate release from the synaptic vesicles in addition to its role in the inhibition of presynaptic calcium influx. The revealed high degree of mGluR4 organization may provide a new ultrastructural basis to explain the depressive effect of mGluR4 on the neurotransmission.
Moreover, I directly imaged GABABR dynamic behavior with high spatiotemporal resolution in living hippocampal neurons utilizing single-molecule total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). To this purpose, the GABAB1 subunit was engineered with an N-terminal SNAP-tag to enable specific labeling with bright organic fluorophores. On the plasma membrane surface, immobile and mobile GABABRs were detected at both synaptic and extrasynaptic compartments. A mean square displacement analysis (MSD) revealed characteristic dynamic patterns of GABABR depending on receptor location inside or outside of the synapses. The majority of receptors belonging to the extrasynaptic pool displayed rapid and free diffusion. In contrast, approximately 80% of receptors residing at the synaptic compartments were immobile or confined within limited regions. Receptors located at pre- and post-synaptic sites showed a similar behavior. GABABR lateral diffusion patterns inside and outside synapses might be important for the regulation of efficacy of synaptic inhibition.
Altogether, this study puts forward previously unknown GPCR nanoscopic details in functional nanodomains. GPCR spatial organization might be important for the efficiency, fidelity, and rapid signaling required for synaptic transmission. / Trotz der großen Anzahl an G Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) die im zentralen Nervensystem (ZNS) exprimiert werden, ist deren Lokalisierung, Anordnung und Dynamik in funktionellen Nanodomänen an Synapsen gegenwärtig weitgehend unbekannt. Klasse C GPCRs, einschließlich metabotroper Glutamatrezeptoren (mGluRs) und des γ- Aminobuttersäure-B-Rezeptors (GABABR), vermitteln einige Schlüsselfunktionen der synaptischen Übertragung. Grundlegende Prinzipien wie diese Rezeptoren an Synapsen funktionieren, um die Neurotransmission zu modulieren, sind jedoch nur unvollständig verstanden. Eine Schwierigkeit ist die Verfügbarkeit von Techniken zur Untersuchung von Rezeptoren mit hoher raum-zeitlicher Auflösung in physiologisch relevanten Zellen. Um die Anordnung und die raum-zeitliche Dynamik von mGluR4 und GABABR in Kleinhirnschnitten und kultivierten hippocampalen Neuronen zu untersuchen, verwendete ich neue optische Verfahren wie Einzelmolekül- und hochauflösende Mikroskopie (dSTORM) mit hoher räumlicher (10-20 nm) und zeitlicher Auflösung (20 ms).
Die präsynaptische aktive Zone (AZ) ist eine hoch organisierte Struktur, die auf die Transmitterausschüttung spezialisiert ist. Der mGluR4 ist ein prototypischer, präsynaptischer Klasse C GPCR. Hauptsächlich durch die Inhibierung spannungsgesteuerter Calciumkanäle des P/Q-Typs (CaV2.1) vermittelt mGluR4 eine inhibitorische Wirkung auf die Glutamatfreisetzung.In dieser Arbeit analysierte ich die Organisation des mGluR4 an der Synapse zwischen parallelen Fasern und Purkinje-Zellen im Kleinhirn der Maus unter Verwendung der Zweifarben direkten stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM). Quantitative Analysen zeigten eine vierfache höhere Anreicherung von mGluR4 an den Parallelfaser-AZs. Ich fand heraus, dass eine AZ im Durchschnitt 29 mGluR4- Nanocluster enthält. Jeder Nanocluster enthält ein oder zwei mGluR4s, wobei wenige Nanocluster drei oder mehr Rezeptoren enthalten. Um die räumliche Verteilung von mGluR4 relativ zu funktionellen Elementen aktiver Zonen, wie CaV2.1 und Munc 18-1( ein wichtiges Protein der exozytotischen Maschinerie), zu bestimmen, wurde die Abstandsbasierte-Co- Lokalisierung-Analyse verwendet. Co-Lokalisierung wurde zwischen mGluR4 und beiden Proteinen in einem Abstand von 40 nm detektiert. Interessanterweise wurde für Munc 18-1 eine höhere positive Korrelation zu mGluR4 identifiziert. Dies deutet darauf hin, dass mGluR4, zusätzlich zu seiner Rolle bei der Hemmung des präsynaptischen Calciumeinstroms, die exozytotische Maschinerie zur Verringerung der Freisetzung von Glutamat aus sekretorischen Organellen direkt hemmen könnte. Der gezeigte hohe Grad der mGluR4-Organisation könnte
eine neue ultrastrukturelle Grundlage zur Erklärung der depressiven Wirkung von mGluR4 auf die synaptische Übertragung liefern.
Außerdem habe ich das dynamische Verhalten von GABABR direkt mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in lebenden hippocampalen Neuronen durch Einzelmolekül-TIRFM visualisiert. Zu diesem Zweck wurde die GABAB1-Untereinheit mit einem N-terminalen SNAP- Tag konstruiert, um eine spezifische Markierung mit hellen organischen Fluorophoren zu ermöglichen. Auf der Oberfläche der Plasmamembran wurden immobile und mobile GABABRs in synaptischen und extrasynaptischen Kompartimenten nachgewiesen. Die mittlere quadratische Verschiebung (mean square displacment analysis (MSD)) zeigte charakteristische dynamische Muster von GABABR in Abhängigkeit der Position der Rezeptoren innerhalb oder außerhalb der Synapsen. Die Mehrheit der Rezeptoren im extrasynaptischen Pool zeigte schnelle und freie Diffusion. Im Gegensatz dazu waren ungefähr 80% der synaptischen Rezeptoren immobile oder auf begrenzte Regionen beschränkt. Rezeptoren an prä- und postsynaptischen Stellen zeigten ein ähnliches Verhalten. GABABR- Diffusionsmuster innerhalb und außerhalb von Synapsen könnten außerdem für die Regulierung der Wirksamkeit der synaptischen Hemmung von Bedeutung sein.
Insgesamt zeigen diese Ergebnisse bisher unbekannte Erkenntnisse zu nanoskopischen Einzelheiten von GPCRs in funktionellen Nanodomänen. Die räumliche Organisation von GPCR kann für die Effizienz, Genauigkeit und schnelle Signalisierung der Neurotransmission wichtig sein.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:17896 |
| Date | January 2020 |
| Creators | Mohamedgamil, Sana Siddig Abdelrahman |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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