Die Steroidhormone Corticosteron/Cortisol und Aldosteron werden in Folge von Stress oder eines veränderten Salz-Wasser-Haushalt durch die Nebenniere synthetisiert und sezerniert. Dies wird durch negative Rückkopplungsmechanismen kontrolliert, die als HPA-Achse und RAAS bezeichnet werden. Die Aktivität dieser Steroidhormone wird durch den Glukokortikoid Rezeptor (GR) und den Mineralokortikoid-Rezeptor (MR) vermittelt, die im Zytosol als Komplex mit Hitze-Schock-Proteinen vorliegen. Sowohl der GR als auch der MR gehören zur Kern-Rezeptor Superfamilie und besitzen eine gemeinsame Proteinstruktur die aus drei verschiedenen Domänen besteht. Trotzdem haben sie verschiedene Affinitäten für ihre Liganden, ihre Aktivität hängt von der Hormonkonzentration ab, sie werden durch Prä-Rezeptor-Mechansimen wie der 11b-HSD2 reguliert und ihre Gewebeverteilung ist unterschiedlich. Aldosteron wirkt in epithelialen und nicht-epithelialen Zellen über den MR und reguliert den Salz-Wasser-Haushalt, die Herzfunktion, die neuronale Erregbarkeit und die Adipozyten-Differenzierung. Bislang war die Analyse der Geninaktivierung in vivo auf Mäuse beschränkt, obwohl Krankheitsmodelle in der Ratte die Verhältnisse im Menschen manchmal besser widerspiegeln. Da embryonale Stammzellen und damit die gezielte Genmanipulation in Ratten nicht verfügbar sind, haben wir MR knock-down Ratten mittels lentiviral eingeführter shRNAs hergestellt. Die F1 Nachkommen der Gründer-Ratten zeigten unterschiedlich stark reduzierte MR mRNA und Protein Niveaus in Niere und Hippocampus, den Hauptexpressions-Regionen des MR. Im Gegensatz dazu war die Expression des GR unverändert, was die Spezifität der Geninaktivierung belegt. Die zwei MR Zielgene Sgk1 und ENaC waren hochreguliert während die mRNA Spiegel anderer Gene wie IK1 und SCD2 erniedrigt waren. Ähnlich wie in den knock-out Mäusen und Patienten zeigten die knock-down Ratten die typischen Merkmale des Pseudohypoaldosteronismus Typ I wie erhöhte Serumspiegel von Aldosteron und Renin sowie Wachstumsretardation. Weiterhin fanden wir einen linearen Zusammenhang zwischen der MR Expression in der Niere, den Serum Aldosteron-Werten und dem Körpergewicht. Zusammengefasst sind unsere MR knock-down Ratten unter den ersten Beispielen für RNAi in vivo und belegen, dass diese Technik es erlaubt, abgestufte Ausprägugen der Geninktivierung wie in humanen genetischen Erkrankungen zu erreichen. Weiterhin haben wir die Rolle des GR und des MR für die immunmodulatorische Aktivität der Glukokortikoide in peritonealen Makrophagen untersucht. GCs sind an der Kontrolle der Makrophagenfunktion beteiligt und regulieren so die Reaktion gegenüber Pathogenen. Aus diesem Grund werden GCs weitverbreitet zur Behandlung von Enzündungen und Autoimmunerkrankungen eingesetzt. Allerdings ist bezüglich dieser GC Aktivitäten weder bekannt welche Kontrolle die Hormonkonzentration spielt noch kennt man den differentiellen Beitrag des GR und des MR. Zuerst bestätigten wir die Expression beider Rezeptoren in peritonealen Makrophagen während die 11b-HSD2 nicht exprimiert war. Anschließend zeigten wir, dass niedrigte Corticosteron-Level die NO Produktion sowie die mRNA Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen, Chemokinen und Enzymen die für die Mediator-Synthesee benötigt werden erhöhen. Im Gegensatz dazu war die Makrophagen Funktion bei hohen Corticosteron-Konzentrationen stark reprimiert. Eine wichtige Beobachtung war, dass die Inaktivierung des GR durch lentiviral eingeführte siRNAs sowohl die immunstimulatorischen als auch die immunsuppressiven GR Aktivitäten aufhob während die Inaktivierung des MR keine Konsequenzen hatte. Weiterhin führte der Verlust endogenener GCs nach Adrenalektomie in vivo zu einem prä-aktivierten Zustand der Makrophagen, welcher durch Corticosteron moduliert werden konnte. Wir schließen hieraus, dass GCs in Abhängigkeit von ihrer Konzentration unterschiedliche Effekte auf die Makrophagen Funktion haben und dass diese durch den GR vermittelt werden, obwohl der MR ebenfalls exprimiert ist. Zusammengefasst bestätigen unsere Ergebnisse dass die lenivirale Transduktion von shRNAs eine effiziente Methode zur Geninaktivierung in primären Zellen und transgenen Ratten darstellt und es so erlaubt, funktionelle Studien durchzuführen die zuvor auf Mäuse beschränkt waren. / The steroid hormones corticosterone/cortisol and aldosterone are synthesized and secreted by the adrenal gland in response to stress or an altered salt-water balance. This is controlled by a negative feedback mechanism referred to as the HPA axis and the RAAS. Actions of these steroid hormones are mediated by the glucocorticoid receptor (GR) and the mineralocorticoid receptor (MR), which reside in the cytoplasm in a complex with heat-shock proteins. Both, the GR and the MR belong to the nuclear receptor superfamily and share a common protein structure consisting of three separate domains. However, they have different affinities for various ligands, their actions depend on hormone concentration, they are modulated by pre-receptor mechanisms such as the 11β-HSD2 and they are differently distributed in several tissues. Aldosterone acts via the MR in epithelial and in non-epithelial cells and regulates sodium-water homeostasis, cardiovascular function, neuronal excitability and adipocyte differentiation. So far the analysis of gene inactivation in vivo was limited to mice, but disease models in rats sometimes more closely reflect the situation encountered in humans. Since embryonic stem cells and thus gene targeting in rats is not available, we generated MR knock-down transgenic rats by lentiviral delivery of a shRNA. The F1 progeny of the founder rats showed a wide range of reduced MR mRNA and protein levels in kidney and hippocampus, the two major sites of MR expression. In contrast, expression of the highly homologous GR was unaltered, indicating specificity of gene inactivation. The two MR target genes, Sgk1 and ENaC, were up-regulated while the mRNA levels of other genes such as IK1 and SCD2 was reduced. Similar to the knock-out mice and human patients, the knock-down rats displayed typical signs of pseudohypoaldosteronism type I such as increased serum levels of aldosterone and renin as well as growth retardation. Importantly, we found a linear relationship between MR mRNA expression in kidney, serum aldosterone levels and body weight. Thus, our MR knock-down rats are amongst the first examples of RNAi in vivo and confirm that this technique allows to accomplish graded levels of gene inactivation that mimick human genetic diseases. Secondly, we investigated the role of the GR and the MR for the immunomodulatory activities of glucocorticoids (GCs) in peritoneal macrophages. GCs are involved in the modulation of macrophage function and thereby control the host’s immune responses to pathogens. Therefore, GCs are widely used for the treatment of inflammation and autoimmune diseases. However, concerning these GC activities neither the role of hormone concentration nor the differential contribution of the GR and the MR are known. At first we confirmed that both receptors but not 11β-HSD2 are expressed in peritoneal macrophages. Next, we showed that low levels of corticosterone enhance NO production as well as mRNA expression of pro-inflammatory cytokines, chemokines and enzymes required for mediator synthesis. In contrast, at high corticosterone concentrations macrophage function was strongly repressed. Importantly, inactivation of the GR by lentiviral delivery of siRNAs abrogated both the immunostimulatory and the immunosuppressive GC actions whereas inactivation of the MR had no effect. Furthermore, removal of endogenous GCs by adrenalectomy in vivo induced a pre-activated state in macrophages that could be modulated by corticosterone. We conclude that GCs exert distinct effects on macrophage function dependent on their concentration, and that they act through the GR despite concomitant expression of the MR. In summary, our results confirm that lentiviral delivery of shRNAs is an efficient means to down-regulation gene expression in primary cells and transgenic rats and thereby allows to perform functional studies on gene function that were previously limited to mice.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:2014 |
| Date | January 2007 |
| Creators | Lim, Hee-Young |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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