Der WNT-Signalweg ist ein hochkonservierter Signalweg, dessen zentraler
intrazellulärer Regulationsschritt die Proteinstabilität des Proteins β-Catenin ist.
Deregulierende Mutationen in diesem sind frühe Ereignisse bei der Entstehung von
Darmtumoren. Ist der Abbau von β-Catenin gestört, so ist unabhängig von äußerer
Kontrolle der Signalweg konstitutiv aktiviert und liefert ein Wachstumssignal.
Untersuchungen haben aber gezeigt, dass beim Vorliegen solcher Mutationen immer
noch eine – unzureichende – Ubiquitinylierung und ein Abbau von β-Catenin stattfindet.
Ziel dieser Studie war Deubiquitinasen (DUBs) zu finden, die durch ihre
Aktivität den Abbau von β-Catenin verhindern. Mithilfe eines siRNA Screens in der
Vorarbeit konnten DUBs als Kandidaten für einen CRISPR Ansatz ausgewählt werden.
APC Wildtyp HEK293T Zellen und Darmkrebszellen wurden mit lentiviralen
CRISPR/Cas9 Vektoren infiziert, in welche sgRNAs gegen exonische Sequenzen von
DUBs geklont waren. Einzelne Zellklone von USP10 CRISPR Zellen wurden weiter
untersucht. In Western Blots und Immunofluoreszenz zeigte sich bei den USP10 CRISPR
Zellen eine verminderte Expression von USP10 und damit einhergehend β-Catenin.
Proteinstabilitätsversuche mit MG132 und Cycloheximid zeigten einen erhöhten Abbau
von β-Catenin in HEK293T USP10 CRISPR Zellen, vor allem nach Stimulierung des
WNT-Signalwegs durch LiCl. In Aktivierungsassays (Luciferase und TOP-GFP FACS)
des WNT-Signalwegs zeigte sich in HEK293T Zellen nach Behandlung mit LiCl eine
geringere Aktivierung in den USP10 CRISPR Zellen. In einem Wachstumsassay zeigten
HT29 USP10 CRISPR ein geringeres Wachstum als Kontrollzellen. Während in einer
histologischen Färbung von Mausgewebe eine erhöhte Expression von USP10
nachweisbar war, zeigten sich in einer TMA Färbung kein eindeutiger Unterschied
zwischen gesundem Gewebe und Tumorgewebe.
Die Studie identifiziert USP10 als eine mögliche DUB für β-Catenin und potenzielles
Ziel für eine Beeinflussung des mutierten WNT-Signalwegs in Darmkrebszellen. / The WNT- signaling pathway is a highly preserved pathway. Its central intracellular regulation
measure is the protein stability of the protein β-Catenin. Mutations that cause a deregulation in said
pathway occur early within the development of intestinal tumors. If the breakdown of β-Catenin is
impaired, the WNT- signaling pathway will get activated constitutively, providing growth signals,
regardless of outer controls. Investigations have shown, that if such mutations exist there will still be
a (insufficient) ubiquitinylation and a breakdown of β-Catenin. It was the aim of this research to
identify deubiquitinases (DUBs) whose activity prevent the breakdown of β-Catenin. It was possible
to select DUBs as potential candidates for a CRISPR approach by using sIRNA Screens. APC Wildtype
HEK293T cells and intestinal tumor cells where infected by lentiviral
CRISPR/Cas9 vectors which contained sgRNAs clones that worked against exonic sequences of DUBs.
Individual cell clones of USP10 CRISPR cells where further investigated. Within western blots and
immunofluorescence USP10 CRISPR cells showed a reduced expression of USP10 and thus, β-
Catenin. Protein stability trials using MG132 and cycloheximide showed an increased breakdown of
β-Catenin in HEK293T USP10 CRISPR cells, especially in response to stimulation of the WNT- signaling
pathway using LiCl. Within activation assays (Luciferase and TOP-GFP FACS) of the WNT- signaling
pathway, a reduced activation in USP10 CRISPR cells after treatment with LiCl was shown within
HEK293T cells. Within a growth assay HT29 USP10 CRISPR showed a reduced growth when
compared to control cells. While there was evidence of an increased expression of USP10 within the
histological coloration of mouse tissue, the TMA coloration did not show a significant difference
between healthy tissue and tumor tissue. This study identified USP10 as a possible DUB for β-
Catenin and as a possible target for the manipulation of the mutations that cause a deregulation
within the WNT- signaling pathway in intestinal tumor cells.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:27299 |
| Date | January 2022 |
| Creators | Christmann, Gabriel |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/doku/lic_ohne_pod.php, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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