Los plásticos se han convertido en el material de mayor y amplio uso en un corto
lapso de tiempo. En este sentido, la dependencia de los plásticos derivados del petróleo
ha aumentado progresivamente en los últimos años y es una de las causas del problema
de la excesiva acumulación de residuos. Los efectos ambientales dañinos provocados
por estos plásticos sintéticos han generado un gran interés en el uso y aplicaciones de
biopolímeros. Sin embargo, los polímeros de origen biológico representan en la
actualidad sólo una pequeña fracción del mercado total mundial de plásticos (menos del
1% del total) y el principal motivo es su alto costo de producción.
Los poli(hidroxialcanoato)s (PHAs) son una familia de biopoliésteres de origen
natural sintetizados por diversos microorganismos. Las características de los PHAs
pueden dar lugar a diversas propiedades adaptables a diferentes aplicaciones industriales
que van desde materiales de embalaje biodegradables hasta diversos productos médicos.
Esto los convierte en candidatos prometedores de interés industrial y con valor
ambiental, ya que además de su diversidad química son biodegradables, piezoeléctricos,
biocompatibles, además de ser fabricados a partir de fuentes de carbono renovables.
Varios factores influyen en la producción de PHAs, tales como la especie de
microorganismo, la duración de la fermentación, la tasa de crecimiento, la naturaleza y
concentración de la fuente de carbono. Entre estos, el factor de mayor influencia en el
costo de producción es la fuente de carbono.
El objetivo de esta tesis fue estudiar y optimizar la producción de PHAs a partir
de sustratos de bajo costo y cepas bacterianas aisladas de ambientes costeros de la
región de Bahía Blanca. Conjuntamente se propuso desarrollar metodologías rápidas y
confiables para evaluar la producción de estos biopolímeros. Con este fin se realizaron
aislamientos de cepas bacterianas productoras de PHA de sedimentos del estuario de
Bahía Blanca. Por screening cualitativos se determinó la presencia del biopolímero
empleando técnicas clásicas de tinción de gránulos internos de PHA. Alternativamente
se utilizó una técnica espectroscópica (espectroscopía infrarroja por transformada de
Fourier (FTIR)) para la detección de la presencia e intensidad de picos característicos
del PHA en muestras de las cepas aisladas. A partir de este screening se seleccionó la
mejor cepa productora de PHA. La cepa seleccionada fue identificada como Bacillus
megaterium BBST4, la cual fue aislada de sedimentos de Estuario de Bahía blanca,
durante un estudio previo llevado a cabo en nuestros laboratorios. Para realizar los
ensayos de optimización fueron seleccionados dos sustratos (glicerol y almidón)
teniendo en cuenta el rendimiento en la producción de PHA demostrado por B.
megaterium BBST4, y en relación a los costos del medio de cultivo y la fuente de
carbono. Como fuente de nitrógeno se seleccionó la urea y un medio de cultivo salino
mínimo. Para la optimización de la producción de PHAs a partir de glicerol como fuente
de carbono se analizó la influencia de distintas variables en la producción de este
biopolímero. A partir del almidón como fuente de carbono se desarrolló la técnica de
diseño experimental por medio de una superficie de respuesta (RSM) como herramienta
estadística robusta. Para las dos condiciones determinadas por RSM donde se obtuvo la
máxima producción de biopolímero, en relación al rendimiento de PHA en cantidad y
en economía (menor costo de producción), se desarrolló un modelado matemático de la
cinética de producción de estos biopolímeros. Se probaron distintas técnicas de
extracción de PHAs a partir de cloroformo como principal solvente de extracción. La
técnica de extracción que presentó los mejores resultados fue optimizada y empleada
para obtener los PHAs producidos por la cepa estudiada a partir de las dos fuentes de
carbono seleccionadas, y a partir de una tercera fuente de carbono para cotejar
diferencias entre sí. Estos PHAs fueron caracterizados por FTIR, Resonancia magnética
nuclear de una dimensión (1H-NMR y 13C-NMR) y dos dimensiones (HSQC),
Calorimetría diferencial de barrido (DSC) y Cromatografía por exclusión de tamaños
(SEC o GPC). Los resultados de caracterización mostraron que los PHAs producido por
B. megaterium BBST4 a partir de las tres fuentes de carbono presentan
aproximadamente un 89,3 mol% de 3HB, un 5,6 mol% de 3HV y un 5,2 mol% de
monómeros de mcl-HA, probablemente con extensión interna de la cadena. En nuestro
conocimiento, este representa el primer reporte de producción de copolímeros
empleando una cepa del genero Bacillus a partir de distintas fuentes de carbono
renovables. Finalmente se desarrolló una nueva técnica para la determinación del PHA
extraíble a partir de células liofilizadas y FTIR. Esta técnica disminuye notablemente
los tiempos de determinación, lo que permite una importante reducción en el tiempo de
toma de decisiones a la hora de definir cuantitativamente el/los momentos de óptima
producción de PHA para realizar la extracción.
Los aportes de esta tesis permiten visualizar un esquema general del proceso de
obtención y optimización de la producción de PHAs. Por lo que representan un punto de
inicio para el estudio de la biosíntesis de PHAs a partir de sistemas biotecnológicos con
diferentes alternativas para la optimización en la detección y cuantificación de estos
biopolímeros. / In a short time plastics have become the material most widely used. In this sense,
the dependence on petroleum-based plastics has progressively increased in recent years
and is one of the causes of the problem of excessive accumulation of waste. The
harmful environmental effects caused by these synthetic plastics have generated great
interest in the use and applications of biopolymers. However, polymers of biological
origin now represent only a small fraction of the total world market for plastic(less than
1% of the total) and the main reason is the high cost of production.
Poly(hydroxyalkanoate)s (PHAs) are a family of naturally occurring biopolyesters
synthesized by various microorganisms. PHAs characteristics may lead to various
properties adaptable to different industrial applications ranging from biodegradable
packaging materials to various medical products. This wide range of applications makes
them in promising candidates with industrial interest and environmental value. Besides
their chemical diversity, they are biodegradable, piezoelectric, biocompatible, in
addition to being produced from renewable carbon sources. Several factors influence the
production of PHAs, such as the species of microorganism, fermentation time, growth
rate, the nature and concentration of the carbon source. Among these, the carbon source
is the most influential factor in the cost of production.
The aim of this thesis was to study and optimize the production of PHAs from
inexpensive substrates and bacterial strains isolated from coastal environments from
Bahia Blanca region. In addition, studies were done for the development of fast and
reliable methodologies for assessing the production of these biopolymers. For this
purpose, PHA producing bacterial strains were isolated from sediments of Bahía Blanca
Estuary. The presence of the internal PHA granules was determined using qualitative
screening with conventional staining techniques for these biopolymers. Alternatively, a
spectroscopic technique (infrared Fourier transform spectroscopy (FTIR)) was used for
detecting the presence and intensity of characteristic peaks of PHA in the samples of
isolated strains. From this screening, the best PHA producing strain was selected. The
selected strain was identified as Bacillus megaterium BBT4, which was isolated in a
previous study carried out in our laboratories. To perform the optimization trials were
selected two substrates (glycerol and starch) considering the yield of PHA production
demonstrated by B. megaterium BBST4, and the costs related to the culture medium and
carbon source. The urea was selected as nitrogen source and a defined minimum salt
medium as culture medium. For the optimization of PHA production from glycerol as
sole carbon source, the influence of several variables in the production of this
biopolymer was analyzed. From starch as carbon source experimental design technique
was developed by a response surface methodology (RSM) as robust statistical tool. For
the conditions determined by RSM, where maximum biopolymer production in relation
to the performance of PHA in quantity and economics (lower production costs) was
obtained, a mathematical modeling of the kinetics of production of these biopolymers
was developed. Different techniques for PHA extraction were tested using chloroform
as principal solvent extraction. The extraction technique that exhibit the best results was
optimized and used to obtain the PHAs produced by the strain from the two carbon
sources previously selected, and from a third carbon source employed to collate
differences between them. These PHAs were characterized by FTIR, nuclear magnetic
resonance of one dimension (1H-NMR and 13C-NMR) and two dimension (HSQC),
differential scanning calorimetry (DSC) and size exclusion chromatography (SEC or
GPC).The characterization results showed that PHAs produced by B. megaterium
BBST4 from the three carbon sources show approximately 89.3 mol% of 3HB, 5.6
mol% of 3HV and 5.2 mol% of mcl-HA monomers, probably with internal chain
extension. To our knowledge, this represents the first report of copolymers production
using a strain of Bacillus spp. from different renewable carbon sources. Finally it
developed a new technique for determining the removable PHA using lyophilized cells
and FTIR. This technique significantly reduces the time of determination, allowing a
significant reduction in time of making decision when it comes to define quantitatively
the moment/s of optimum PHA production to perform the extraction.
The contributions of this thesis allow visualizing an overview of the process of
obtaining and optimization of the PHAs production. Therefore they represent a starting
point for the study of the biosynthesis of PHAs from biotechnological systems with
different alternatives for optimizing the detection and quantification of these
biopolymers.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uns.edu.ar/oai:repositorio.bc.uns.edu.ar:123456789/2676 |
| Date | 30 March 2016 |
| Creators | Porras, Mauricio Ariel |
| Contributors | Cubitto, María Amelia, Villar, Marcelo Armando |
| Publisher | Universidad Nacional del Sur |
| Source Sets | Universidad Nacional del Sur |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
| Rights | 2 |
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