Caenorhabditis elegans es un nematodo de vida libre utilizado como organismo modelo
en diferentes disciplinas de la ciencia. Su tamaño reducido, plan corporal anatómicamente
simple, ciclo de vida corto y amplio repertorio de comportamientos, lo han transformado en un
organismo muy útil en investigación. Además, emerge como un modelo de interés en la industria
farmacéutica para realizar ensayos in vivo rápidos y económicos, y para la detección de
compuestos con actividad biológica.
C. elegans comparte características fisiológicas y farmacológicas con nematodos
parásitos y además es sensible a la mayoría de las drogas antiparasitarias que se utilizan en el
hombre y en los animales. Dado que es difícil trabajar con nematodos parásitos en el laboratorio,
C. elegans ha emergido como un excelente modelo de nematodo parásito y ha contribuido al
conocimiento de los mecanismos de acción de diversos fármacos.
C. elegans cuenta con la mayor familia de receptores Cys-loop. En sus músculos, posee
tres receptores Cys-loop principales: dos receptores nicotínicos (nAChRs), el L-AChR y el N-AChR,
y el receptor de GABA, UNC-49. Los nAChRs median la contracción de los músculos de la pared
del cuerpo mientras que los receptores de GABA median la relajación muscular, permitiendo el
movimiento sinusoidal típico del nematodo.
Estos receptores son los blancos moleculares de drogas antihelmínticas. El levamisol,
actuando como agonista del L-AChR, genera contracción sostenida de los músculos y finalmente
la parálisis espástica del nematodo. La piperazina, actuando como agonista de los receptores de
GABA, genera relajación muscular y parálisis flácida.
Otros receptores Cys-loop presentes en el nematodo también son blancos de fármacos
antihelmínticos. El receptor de glutamato permeable a cloruro (GluCl) presente en neuronas y
células musculares es el blanco molecular de la ivermectina (IVM), uno de los antiparasitarios
más utilizados a nivel mundial.
En cuanto a los receptores Cys-loop, C. elegans no es más diferente a los nematodos
parásitos de lo que cada especie individual de parásito lo es de otra. Esto se evidencia en la
amplia diversidad de subunidades que generan receptores Cys-loop con diferente composición
y propiedades farmacológicas en los nematodos y cuyas bases moleculares no se comprenden
completamente.
En esta Tesis se utilizó a C. elegans como modelo de nematodo parásito. Se estudiaron
las propiedades antihelmínticas y los blancos de acción de diferentes compuestos químicos a
través de ensayos de comportamiento. Para determinar sus mecanismos de acción se realizaron
registros electrofisiológicos de corrientes unitarias y macroscópicas sobre receptores presentes
en células musculares de C. elegans o expresados heterologamente en células de mamífero.
En el Capítulo 1 se estudió el befenio, un antihelmíntico colinérgico cuyo modo de acción
no se conocía completamente. Mediante ensayos de comportamiento se determinó que befenio
genera parálisis espástica en nematodos salvajes adultos jóvenes. Utilizando cepas mutantes se
determinó que el L-AChR es el blanco molecular involucrado en la actividad paralizante de
befenio. Estos resultados sugieren que no existiría un receptor específico para befenio en los
músculos de C. elegans. Cuando befenio fue combinado con levamisol el efecto paralizante fue
aditivo. Esto es de importancia ya que la combinación de drogas es una buena estrategia para
reducir la resistencia en nematodos parásitos.
A nivel molecular, mediante registros de canal único, se determinó que befenio activa
el L-AChR de C. elegans tanto en larvas L1 como L2, y a mayores concentraciones, actúa como
un bloqueador de canal abierto de dicho receptor. Los estudios de docking molecular mostraron
que befenio se une al sitio de unión ortostérico del agonista y forma las interacciones cation-π
requeridas para la activación del receptor. Estos resultados podrían explicar la alta eficacia para
activar el L-AChR.
La selectividad de befenio por el nAChR muscular de mamífero fue estudiada mediante
registros de canal único y de corrientes macroscópicas. Se determinó que befenio activa el
nAChR pero actúa como un agonista muy débil y un bloqueador de canal potente. Según
estudios de docking molecular, befenio generaría las interacciones necesarias para la activación
solamente en uno de los dos sitios ortostéricos del receptor. Esto explicaría su baja eficacia en
receptores de mamífero con respecto a los receptores de nematodos.
Cepas mutantes de C. elegans que carecen de la subunidad LEV-8 podrían contener LAChRs
formados por la subunidad ACR-8 en su reemplazo. Estos L-AChRs imitan un receptor de
nematodo parásito, como el receptor de H. contortus, cuya subunidad ACR-8 podría mediar la
actividad de befenio. Mediante ensayos de comportamiento con la cepa mutante se determinó
que la subunidad ACR-8 no es requerida para el efecto paralizante de befenio en C. elegans. A
nivel de canal único, los receptores que carecen de la subunidad LEV-8 también fueron activados
por befenio y dicha droga, al igual que ACh, indujo una rápida desensibilización del receptor.
En el Capítulo 2 se estudiaron tres terpenoides, carvacrol, timol y eugenol, presentes en
plantas. Mediante ensayos de comportamiento utilizando nematodos salvajes, se determinó
que los terpenoides paralizan rápidamente a C. elegans. El orden de potencia de parálisis fue:
carvacrol>timol>eugenol. Las larvas fueron más sensibles que los nematodos adultos jóvenes.
Además, los compuestos inhibieron irreversiblemente la eclosión de los huevos con el mismo
orden de potencia. Estos hallazgos indican que los terpenoides producen efectos
antihelmínticos a corto y largo plazo.
Se evaluaron tres combinaciones de drogas: timol/levamisol, timol/piperazina y
timol/ivermectina. El efecto paralizante de la combinación timol/levamisol fue sinérgico y dicha
combinación también fue efectiva en la inhibición de la eclosión de huevos.
Mediante ensayos de comportamiento con nematodos mutantes se determinó que los
L-AChRs y los receptores de GABA son los blancos moleculares de los terpenoides. Los registros
de corrientes macroscópicas revelaron que los compuestos no son capaces de activar los
receptores, pero inhiben las corrientes evocadas por los agonistas. En registros de canal único,
los terpenoides disminuyeron la actividad de L-AChRs generada por ACh y levamisol, redujeron
la frecuencia de aperturas del L-AChR e indujeron un componente de estado cerrado más
prolongado. Sin embargo, no afectaron las propiedades del canal como la conductancia y la
duración de apertura. El análisis global indicó que los terpenoides ejercen su efecto
antihelmíntico actuando como antagonistas no competitivos del L-AChR.
En el Capítulo 3 se estudió la doxepinona, considerada una estructura química
privilegiada. Mediante ensayos de comportamiento se demostró que la doxepinona ejerce su
acción paralizante sobre nematodos salvajes adultos jóvenes actuando a través el GluCl, el
blanco molecular de la IVM. Este compuesto sintético generó parálisis estacionaria en
nematodos salvajes.
La IVM actúa sobre GluCls presentes en la faringe del nematodo e inhibe el bombeo
faríngeo. Doxepinona también redujo la velocidad de bombeo faríngeo en nematodos salvajes
y el efecto fue mediado por los GluCls.
Mediante registros de corrientes macroscópicas se caracterizaron las corrientes del
receptor heteromérico GluCl α 1/GluClß de C. elegans evocadas por el agonista glutamato. Se
determinó que la doxepinona no es un agonista de dicho receptor ya que no es capaz de
activarlo. Mediante diferentes protocolos de aplicación de drogas, se determinó que la
doxepinona actúa como un inhibidor alostérico de los GluCls. Se propuso a la inhibición del GluCl
como un nuevo mecanismo antihelmíntico.
En resumen, en esta Tesis Doctoral, utilizando a C. elegans como modelo de nematodo
parásito, se identificaron los sitios y se descifraron los mecanismos de acción molecular de
diferentes compuestos químicos, con actividad antihelmíntica. / Caenorhabditis elegans is a free-living nematode used as a model organism in different
science disciplines. Its reduced size, anatomically simple body plan, short life cycle and broad
repertoire of behaviours have turned it in a useful organism for research. It also emerges as an
interesting model in the pharmaceutical industry for fast and cheap in vivo assays and for the
detection of compounds with biological activity.
C. elegans shares pharmacological and physiological characteristics with parasitic
nematodes and is sensitive to most antiparasitic drugs used in humans and animals. Given that
parasitic nematodes are difficult to work with in the laboratory, C. elegans has emerged as an
excellent parasitic model and has contributed to the understanding of mechanisms of action of
anthelmintic drugs.
C. elegans has the largest Cys-loop receptor family. In its muscle, it has three main Cysloop
receptors: two nicotinic receptors (nAChRs), L-AChR and N-AChR, and the UNC-49 GABA
receptor. nAChRs mediate body wall muscle contraction while GABA receptors mediate muscle
relaxation, thus allowing the typical sinusoidal movement of the nematode.
These receptors are the molecular targets of anthelmintic drugs. Levamisole, acting as
an L-AChR agonist, generates sustained muscle contraction which ends in spastic paralysis of the
nematode. Piperazine, by acting as an agonist of GABA receptors, generates muscle relaxation
and flaccid paralysis.
Other Cys-loop receptors in the nematode are also targets of anthelmintic drugs. The
glutamate-activated chloride channel (GluCl) present in neurons and muscle cells is the
molecular target of ivermectin (IVM), which is one of the most used antiparasitic drug
worldwide.
Considering Cys-loop receptors, C. elegans is no more dissimilar to parasitic nematodes
than each individual species of parasite is to another. This results from the wide subunit diversity
that generates Cys-loop receptors with different compositions and pharmacological properties
among nematodes; the molecular basis of this diversity remains not fully understood.
In this Thesis, C. elegans was used as parasitic nematode model. The anthelmintic
properties and molecular targets of different chemical compounds were studied through
behavioural assays. To determine their mechanisms of action, electrophysiological recordings,
single-channel and macroscopic current recordings, were carried out in C. elegans muscle cells
or in mammalian cells heterologously expressing the receptor under study.
In Chapter 1 bephenium was studied. It is a cholinergic anthelmintic drug whose
mechanism of action was not fully understood. Through behavioural assays it was determined
that bephenium generates spastic paralysis in young adult wild-type worms. By using different
mutant strains, it was determined that L-AChR is the molecular target involved in the paralyzing
activity of bephenium. The results suggested that there may not be a specific receptor for
bephenium in C. elegans muscle. When bephenium was combined with levamisole, the
paralyzing effects were additive; which is of significance since drug combination is a good
strategy to reduce resistance in parasitic nematodes.
At the molecular level, through single channel recordings, it was determined that
bephenium activates L-AChR in larvae L1 and L2 C. elegans. At higher concentrations, it acted as
an L-AChR open channel blocker. Molecular docking studies showed that bephenium binds to
the orthostetic agonist binding site and forms the cation-π interactions required for receptor
activation. This result may explain the high efficacy for L-AChR activation.
Bephenium selectivity for the mammalian muscle nAChR was studied through singlechannel
and macroscopic current recordings. Bephenium activated nAChRs, but it acted as a
very weak agonist and a potent channel blocker. According to the molecular docking studies,
bephenium would generate the necessary interactions for activation only in one of the two
orthosteric sites of the receptor. This may explain the low efficacy in the mammalian receptor
with respect to nematode receptors.
C. elegans mutant strains that lack LEV-8 subunit may have L-AChRs containing the spare
ACR-8 subunit in its replacement. These L-AChRs may mimic those in certain nematode
parasites, like the H. contortus receptor, for which it was suggested that its ACR-8 subunit may
mediate bephenium activity. Through behavioural assays in the mutant strain, it was determined
that the ACR-8 subunit is not required for the paralyzing effects of bephenium on C. elegans. At
the single channel level, the receptors that lack LEV-8 subunit were similarly activated by
bephenium. Bephenium, like ACh, induced fast receptor desensitization.
In the Chapter 2 terpenoids present in plants (carvacrol, thymol and eugenol) were
studied. Through behavioural assays in wild-type nematodes, it was determined that terpenoids
produced fast paralysis of the worms. The paralyzing potency order was: carvacrol > thymol >
eugenol. The larvae were more sensitive than young adults. Also, the compounds irreversibly
inhibited egg hatching with the same potency order. These findings indicate that terpenoids
generate short- and long-term anthelmintic effects.
Three drug combinations were evaluated: thymol/levamisole, thymol/piperazine and
thymol/ivermectin. The paralyzing effect of thymol/levamisole combination was synergic, and
this combination was effective in the inhibition of egg hatching too.
Through behavioural assays in mutant nematodes, it was determined that L-AChRs and
GABA receptors are the molecular targets of the terpenoids. The macroscopic current recordings
revealed that the compounds could not activate the receptors but inhibited the currents evoked
by the agonists. In single channel recordings, terpenoids reduced L-AChR activity generated by
ACh and levamisole, reduced the frequency of L-AChR openings and induced a longer closed
state component. However, terpenoids did not affect channel properties, such as conductance
and open duration. The global analysis indicated that, terpenoids exert their anthelmintic effect,
acting as L-AChR non-competitive antagonists.
In the Chapter 3, doxepinone was studied. Doxepinone is considered a privileged
chemical structure. Through behavioural assays, it was demonstrated that doxepinone exert the
paralyzing action in wild-type young adult worms acting through GluCls, which are the molecular
targets of IVM. The synthetic compound generated stationary paralysis on wild-type worms.
IVM acts on nematode pharyngeal GluCls and inhibits pharyngeal pumping. Doxepinone
also reduced the pharyngeal pumping rate in wild-type worms and the effect was mediated by
GluCls.
Through macroscopic current recordings, the responses of GluCl α1/GluClß receptors
of C. elegans evoked by the agonist glutamate were characterized. It was determined that
doxepinone is not a GluCl agonist because it is not capable of activating the receptor. Through
different drug application protocols, it was determined that doxepinone acts as an allosteric
inhibitor of GluCls. The inhibition of GluCls was proposed as a new anthelmintic mechanism.
In summary, in this Doctoral Thesis, using C. elegans as a model of parasitic nematode,
the target sites and mechanisms of action of different chemical compounds with anthelmintic
activity were deciphered.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uns.edu.ar/oai:repositorio.bc.uns.edu.ar:123456789/5577 |
| Date | 18 March 2021 |
| Creators | Turani, Ornella |
| Contributors | Bouzat, Cecilia |
| Publisher | Universidad Nacional del Sur |
| Source Sets | Universidad Nacional del Sur |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
| Format | application/pdf |
| Rights | 2 |
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