Η cAMP αποτελεί ένα σημαντικό δεύτερο μήνυμα που ρυθμίζει την ανοσολογική απόκριση. Η αύξηση της ενδοκυττάριας cAMP αυξάνει την παραγωγή της IL-10 από μονοκύτταρα. Σκοπός της μελέτης είναι η αποσαφήνιση της συμμετοχής της cAMP στην παραγωγή της IL-10 από Τ-λεμφοκύτταρα όπου τα δεδομένα είναι ακόμα ασαφή.
Ανθρώπινα Τ-λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος διεγέρθηκαν με anti-CD3/anti-CD28, anti-CD3 ή Ionomycin/PMA παρουσία ή απουσία παραγόντων που αυξάνουν την ενδοκυττάρια cAMP (10-6 Μ Forskolin, 10-6 Μ PGE2, 5x10-6 Μ Rolipram και 10-6 Μ 8-Br-cAMP). Το πρωτεϊνικό προϊόν της IL-10 μετρήθηκε με ELISA ενώ η παραγωγή mRNA της IL-10 με Real Time PCR. Η ενεργότητα του υποκινητή της IL-10 ελέγχθηκε με διαμόλυνση των κυττάρων με πλασμίδια που φέρουν τον υποκινητή του γονιδίου (1327 bp) ή τμήματα αυτού (-1010, -500, -310, -235, -135 bp). Η δέσμευση των μεταγραφικών παραγόντων MEF-2 και CREB ελέγχτηκε σε πυρηνικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα με πειράματα EMSA, ενώ η ενεργότητα τους ελέγχθηκε με πειράματα διαμολύνσεως με πλασμίδια που ελέγχουν την ενεργότητα της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο των MEF-2 και CREB.
Αύξηση της cAMP ελαττώνει την παραγωγή της IL-10 σε πρωτεϊνικό επίπεδο κατά 50-60% μετά από διέγερση με Ion/PMA, και κατά 80-90% με anti-CD3 ή με anti-CD3/anti-CD28. Η IL-10 παράγεται ακόμα και μετά από διέγερση μόνο με anti-CD3, εύρημα ειδικό για την IL-10, καθώς δεν παρατηρήθηκε αύξηση της παραγωγής άλλων κυτταροκινων (IL-2 & IL-4). Η ελάττωση της παραγωγής της IL-10 αντανακλάται και σε επίπεδο mRNA όπου οι αντίστοιχες μειώσεις είναι κατά 50% με όλους τους τρόπους διέγερσης. Η ενεργότητα του υποκινητή της IL-10 δεν επηρεάζεται από αλλαγές στα επίπεδα της cAMP όταν η διεγερση παρακάμπτει τον Τ κυτταρικό υποδοχέα. Ωστοσο, μειώνεται παρουσία αυξημένων συγκεντρώσεων cAMP όταν τα κύτταρα διεγείρονται μέσω του Τ κυτταρικού υποδοχέα. Το τμήμα του υποκινητή της IL-10 που επηρεάζεται από την ανασταλτική δραση της cAMP (50 % αναστολή) βρίσκεται στις πρώτες 500 bp πριν το TATA box, και περιέχει σημεία πρόσδεσης των μεταγραφικών παραγόντων MEF-2 και CREB, όπως ελέγχθηκε με το πρόγραμμα Consite. Η δέσμευση του MEF-2 σε πυρηνικά εκχυλίσματα διεγερμένων Τ-λεμφοκυττάρων μειώνεται κατά 70% παρουσία αυξημένης cAMP ενώ η ενεργότητα του δεν επηρεάζεται σημαντικά. Αντίθετα, η αύξηση της cAMP αυξάνει τόσο τη δέσμευση (x 2,5) όσο και την ενεργότητα του CREB (x 2).
Η δράση της cAMP στην παραγωγή της IL-10 είναι ειδική για τα Τ-λεμφοκύτταρα και εξαρτάται από τον τρόπο διέγερσής τους. Η ρύθμισή της γίνεται τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε μετά-μεταγραφικό επίπεδο. Η αύξηση της cAMP μπορεί να επηρεάσει την παραγωγή IL-10 από τα Τ-λεμφοκύτταρα παρεμβαίνοντας στην δέσμευση και την ενεργότητα των παραγόντων μεταγραφής MEF-2 και CREB. Ο τρόπος της αλληλεπίδρασης/συνεργασίας των MEF-2 και CREB παραμένει υπό διερεύνηση. / cAMP is a second messenger playing a crucial role in the signal transduction which controls the immune response, while IL-10 is considered to be an important regulator of this response. Elevation of intracellular concentration of cAMP has been shown to increase IL-10 production by monocytes. The aim of this study was the elucidation of the role of cAMP in IL-10 production by normal T lymphocytes, a mechanism that remains unclear.
Fresh Human Τ-lymphocytes derived from PBMC of healthy donors where stimulated with anti-CD3/anti-CD28 or Ionomycin/PMA, in the presence or absence of cAMP elevating agents (10-6 Μ Forskolin, 10-6 Μ PGE2, 5x10-6 Μ Rolipram and 10-6 Μ 8-Br-cAMP). The protein product of IL-10 was measured by ELISA, the production of IL-10 mRNA by Real Time PCR and IL-10 mRNA stability was determined by the use of Actinomycin D (10 μM). The activity of IL-10 promoter was measured by luciferase reporter assay, after transfection of cells with plasmids carrying the wild type promoter (1037bp) or promoter fragments (constructs of -1010, -500, -310, -235, -135bp). PKA role was examined either by cotransfection experiments with a plasmid carrying a constitutively active mutant of the catalytic subunit of PKA-α isoform, or by the use of a specific PKA inhibitor Rp-8- Br-cAMP (10-50 μM). The presence of binding sites of transcription factors in the first 500bp of the IL-10 promoter, was validated using the web-based program CONSITE. Binding of the transcription factors MEF2 and CREB was investigated in nuclear extracts of stimulated human T cells with EMSA experiments. The activity of MEF2 and CREB was investigated independently with transfection experiments using plasmids containing the lusiferase reporter under the control of the transcription factors.
Intracellular cAMP elevation, inhibits IL-10 protein production by 50-60%, when T cells are stimulated with Ionomycin/PMA, and by 80-90% after stimulation with anti-CD3 or anti-CD3/anti-CD28, while PKA blocking by Rp-8- Br-cAMP reversed cAMP mediated inhibition.. IL-10 steady state mRNA levels follow the same pattern of inhibition only after anti-CD3/anti-CD28 stimulation. cAMP elevation decreases IL-10 mRNA stability after I/PMA stimulation, whereas in the anti-CD3/anti-CD28 stimulated cells, the mechanism of inhibition is mainly transcriptional. IL-10 promoter activity is reduced up to 60% when cells are stimulated with anti CD3/anti CD28 in the presence of cAMP elevating agents, but is not affected after stimulation with Ionomycin/PMA or cotransfection of the cells with constitutively active PKA mutant. Transfection assays with the different IL-10 promoter fragments revealed that the most responsible part of IL-10 promoter to cAMP mediated inhibition, is the first 500 bp after the TATA box. This part contains binding sites for the transcription factors MEF-2 and CREB, as validated by the web-based program Consite. Increased intracellular cAMP reduces the binding of MEF2 to nuclear extracts of stimulated T cells by 70 %, however its activity is not affected significantly. On the contrary, both the binding and the activity of CREB are increased in the presence of elevated cAMP.
cAMP mediated inhibition of IL-10 production is PKA mediated and specific for T lymphocytes, depending on the nature/strength of stimulation. cAMP-dependent regulation of IL-10 production is controlled by transcriptional and/or post-transcriptional mechanisms depending on the nature of stimulus. Transcriptional mechanisms involve the transcription factors MEF2 and CREB, however the exact mechanisms of action of these factors deserves further elucidation. Cell and stimulus specific mechanism of regulation of IL-10 production is necessary for its immunoregulatory function.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/1396 |
| Date | 19 February 2009 |
| Creators | Λιόπετα, Κασσιανή |
| Contributors | Παληογιάννη, Φωτεινή, Δημητρακόπουλος, Γεώργιος, Αναστασίου, Ευάγγελος, Φλωρδέλλης, Χριστόδουλος, Παπαβασιλείου, Αθανάσιος, Παληογιάννη, Φωτεινή, Θυφρονίτης, Γεώργιος, Λυγερού, Ζωή |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0038 seconds