Η αποικοδόμηση των πρωτεϊνών είναι μια διαδικασία απαραίτητη για τη
διατήρηση της ομοιόστασης του κυττάρου. Ένας από τους κύριους μηχανισμούς
αποικοδόμησης των βραχύβιων πρωτεϊνών καθώς και όσων εμφανίζουν
λανθασμένη αναδίπλωση, χωρεί μέσω του μονοπατιού ουβικιτίνης-
πρωτεασώματος. Η ουβικιτινίωση είναι μια μετα-μεταφραστική διαδικασία, η
οποία έγκειται στη σηματοδότηση των υποψήφιων για αποικοδόμηση πρωτεϊνών
με ουβικιτίνη και περιλαμβάνει τρεις ενζυμικές ενεργότητες: Ε1 (εκκινητής
ουβικιτίνης), Ε2(μεταφορέας ουβικιτίνης) και Ε3 (λιγάση ουβικιτίνης).
Η πρωτεΐνη Arkadia (Rnf11) είναι μια Ε3 λιγάση ουβικιτίνης με συνολικό
μήκος 994 αμινοξέα. Σε μοριακό επίπεδο, ενισχύει το TGF-β σηματοδοτικό
μονοπάτι, διαμεσολαβώντας την εξαρτώμενη από το πρωτεάσωμα αποικοδόμηση
των αρνητικών ρυθμιστών του, c-Ski και Sno-N. Η δραστικότητα Ε3 λιγάσης
ουβικιτίνης εδράζεται στον C΄-τελικό RING-H2 τομέα, που σχηματίζεται από τα
τελευταία 60 περίπου αμινοξέα της ακολουθίας. Η δομή και η σταθερότητα του RING τομέα
εξαρτώνται από την πρόσδεση δύο ιόντων Zn μέσω ενός χαρακτηριστικού μοτίβου,
που περιλαμβάνει 6 κυστεϊνικά και 2 ιστιδινικά κατάλοιπα.
Στην προσπάθεια αποσαφήνισης της σχέσης δομής-δράσης της πρωτεΐνης
Arkadia, ένα από τα κατάλοιπα που συναρμόζονται με Zn -συγκεκριμένα η His965-
αντικαταστάθηκε από κυστεΐνη μέσω κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης. Η
μετάλλαξη αυτή, με την οποία, ουσιαστικά, μετατρέψαμε τον RING-H2 σε RING-HC
τομέα, μελετήθηκε με χρήση πολυπυρηνικής/πολυδιάστατης φασματοσκοπίας
πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). H NMR δομή του RING-H2 τομέα της
Η965C Arkadia επιλύθηκε σε υψηλή διακριτικότητα (tf=0.94±7.53*10-2,
RMSD=0.75±0.20 και RMSD=1.45±0.24 για τα άτομα του πολυπεπτιδικού σκελετού
και τα βαρέα άτομα αντίστοιχα) και αποκάλυψε μια ββαββ τοπολογία. Παράλληλα,
πραγματοποιήθηκε μελέτη κινητικότητας, από την οποία προέκυψε ότι η εν λόγω
μετάλλαξη υφίσταται ως μονομερές και διαθέτει έναν συμπαγή πυρήνα, που
περικλείεται μεταξύ δύο ευκίνητων άκρων. / Protein degradation is necessary for the maintenance of cell homeostasis. A
major mechanism for the degradation of short-lived as well as misfolded proteins
involves the ubiquitin-proteasome pathway. Ubiquitination is a post translational
modification, which targets the proteins to be degraded through the covalent
attachment of a ubiquitin tag and consists of three enzyme activities: Ε1 (ubiquitin
activator), E2 (ubiquitin carrier) and E3 (ubiquitin ligase).
Arkadia (Rnf11) is a 994 amino acid protein, which acts as an E3 ubiquitin
ligase. On a molecular level, Arkadia enhances TGF-β signaling by mediating the
proteasome-dependent degradation of its negative regulators, c-Ski and Sno-N. Its
E3 ubiquitin ligase activity lies on a C΄-terminal RING-H2 domain, formed by the last
60 residues. The structure as well as stability of the RING finger domain depend
strongly on the binding of two zinc ions in a unique ΄΄cross-brace΄΄ arrangement
through a defined motif of six cysteines and two histidines.
Trying to elucidate the structure-activity relationship in the case of Arkadia,
one of the amino acid ligands –specifically His965- was replaced by cysteine through
site-directed mutagenesis. This particular mutation, which, in reality, transformed
the RING-H2 to a RING-HC domain, was studied with the use of
multinuclear/multidimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR).
The NMR solution structure of the H965 Arkadia RING-H2 domain was determined in
high resolution (tf=0.94±7.53*10-2, RMSD=0.75±0.20 και RMSD=1.45±0.24 for
backbone and heavy atoms respectively) and revealed a ββαββ topology.
Furthermore, a mobility study was conducted with the following results: the mutated
protein is not expected to form dimers and shows a compact core region including the
four metal binding motifs flanked by two flexibly disordered termini.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/6324 |
| Date | 11 October 2013 |
| Creators | Βλάχου, Πολυτίμη-Μαρία |
| Contributors | Σπυρούλιας, Γεώργιος, Vlachou, Polytimi-Maria, Λάμαρη, Φωτεινή, Μαργιωλάκη, Ειρήνη, Σπυρούλιας, Γεώργιος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0025 seconds