Η Νόσος του Πάρκινσον (ΝΠ) χαρακτηρίζεται κυρίως από εκλεκτική και βαθμιαία εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων της μέλαινας ουσίας (SNPc) του μεσεγκεφάλου. Ο "weaver" μυς αποτελεί ένα ιδανικό μοντέλο για τη μελέτη της Νόσου του Πάρκινσον δεδομένου ότι η εκφύλιση του μοντέλου "weaver" είναι προοδευτική, ξεκινάει την 7η μέρα μετά τη γέννηση, είναι δραματική μέχρι την 21η μέρα όπου το 50% των ντοπαμινεργικών νευρώνων έχει ήδη πεθάνει και στην ηλικία των 2 μηνών φτάνει στο 65%.
Στη νόσο του Πάρκινσον, η εκφύλιση της μελαινοραβδωτής οδού, έχει ως αποτέλεσμα να χάνεται ο έλεγχος της εύρυθμης λειτουργίας των δύο νευρικών οδών εξόδου της πληροφορίας από τα βασικά γάγγλια, της "άμεσης" και της "έμμεσης" οδού. Το αποτέλεσμα είναι υπέρμετρη δραστηριότητα της "έμμεσης" οδού που οδηγεί στις κινητικές δυσλειτουργίες της νόσου (βραδυκινησία, τρόμος σε ηρεμία, ακαμψία, αστάθεια θέσης). Πρώτος στόχος της παρούσας εργασίας ήταν να διερευνηθεί κάτω από ντοπαμινεργική απονεύρωση στο μυ "weaver" η μεταγωγή σήματος των Α2A υποδοχέων αδενοσίνης (A2ARs), οι οποίοι αλληλεπιδρούν ανταγωνιστικά με τους D2 υποδοχείς ντοπαμίνης στους νευρώνες της "έμμεσης" οδού. Για το λόγο αυτό μελετήσαμε μετά από διέργεση των Α2A υποδοχέων, την "in vivo" φωσφορυλίωση της DΑRΡΡ-32 στη θέση Τh34, κεντρικό μόριο στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος των Α2A υποδοχέων. Επιπλέον μελετήθηκε εάν κάτω από τη ντοπαμινεργική απονεύρωση οι Α2Α υποδοχείς αλλάζουν μονοπάτι μεταβίβασης σήματος. Οπότε μελετήσαμε την εμπλοκή της οδού των MAP-κινασών με την ανίχνευση της φωσφορυλίωσης των ERK1/2 κινασών. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν, αυξημένα βασικά επίπεδα των φωσφορυλιωμένων DARPP-32 στη θέση Thr34 και ERK1/2 πιθανώς, ως ένα φαινόμενο προσαρμογής στο ντοπαμινεργικό νευροεκφυλισμό. Η διέγερση των Α2Α υποδοχέων οδηγεί σε περαιτέρω αύξηση των επίπεδων φωσφορυλίωσης της DARPP-32 αυξάνοντας περαιτέρω τη δραστηριότητα της "έμμεσης" οδού και επιδεινώνοντας τα συμπτώματα της νόσου. Η διέγερση των Α2Α υποδοχέων ρυθμίζει αρνητικά την αυξημένη φωσφορυλίωση των ERK1/2 κινασών ενώ οι ανταγωνιστές των Α2Α υποδοχέων έχουν ακριβώς αντίθετη δράση. Αυτό το αποτέλεσμα ενδεχομένως να έχει κλινική σημασία δεδομένου ότι, ο αποκλεισμός των υποδοχέων Α2Α με χρήση ειδικών ανταγωνιστών χρησιμοποιείται ήδη σε κλινικές δοκιμές για τη μείωση των συμπτωμάτων της νόσου. Σύμφωνα με τα δικά μας αποτελέσματα όμως η χρήση ανταγωνιστών των Α2Α υποδοχέων αυξάνει τη φωσφορυλίωση των ERK1/2 κινασών, η ενεργοποίηση των οποίων έχει συνδεθεί με τις δυσκινησίες που προκαλούνται από τη χρόνια χορήγηση της L-Dopa. Για το λόγο αυτό η ρύθμιση της ενεργοποίησης των ERK1/2 κινασών μέσω των Α2Α υποδοχέων κάτω από τη ντοπαμινεργική απονεύρωση πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω.
Δεδομένου ότι δεν υπάρχει θεραπευτική αγωγή για τη ΝΠ, δεύτερος στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση της νευροπροστατευτικής δράσης βασικά των "Νευροστεροειδών" αλλά και άλλων ήπιων παραγόντων, μεμονωμένα και σε συνδυασμό, στο μοντέλο "weaver". Η χορήγηση των φαρμακευτικων παραγόντων εφαρμόστηκε πριν την έναρξη της εκφύλισης, από την 1η μετεμβρυϊκή ημέρα (Ρ1) και καθ’ όλη τη διάρκεια που αυτή εξελίσσεται με καταιγιστικό ρυθμό, μέχρι την 21η μέρα της γέννησης, (Ρ21) που η εκφύλιση αγγίζει το 50%. Για την εκτίμηση της νευροπροστατευτικής δράσης μετρήθηκε με ανοσοϊστοχημεία ο αριθμός των ντοπαμινεργικών κυττάρων της μέλαινας ουσίας που επιβίωσαν. Μελετήθηκαν ακόμα, η έκφραση της τυροσίνης της υδροξυλάσης (TH) και η έκφραση του μεταφορέα της ντοπαμίνης (DAT) των τελικών απολήξεων των ντοπαμιμνεργικών ινών στο ραβδωτό σώμα. Η "in vivo" χρόνια χορήγηση (Ρ1-Ρ21) των "Νευροστεροειδών" DHEA, BNN-50 και του συνδυασμού BNN-50 και NAC οδήγησε σε σημαντική επιβίωση των κυττάρων της μέλαινας ουσίας στο "weaver" μυ. Επιπλέον η χορήγηση του BNN-50 καθώς και του συνδυασμού BNN-50/NAC παρέχουν προστασία και στους τελικούς ντοπαμινεργικούς νευράξονες στο ραβδωτό σώμα, υποδεικνύοντας ότι διέσωσαν τις λειτουργικές ντοπαμινεργικές απολήξεις.
Τέλος, τρίτος στόχος ήταν να διερευνηθεί ο μηχανισμός μέσω του οποίου πραγματοποιείται η "in vivo" νευροπροστατευτική δράση των "Νευροστεροειδών". Διερευνήσαμε λοιπόν την έκφραση των TrkA υποδοχέων στα κύτταρα της μέλαινας ουσίας των φυσιολογικών και "weaver" μυών. Ο αντιαποπτωτικός μηχανισμός δεν φαίνεται να πραγματοποιείται μέσω του TrkA υποδοχέα όπως έχει δειχθεί σε "in vitro" πειράματα σε PC12 κυτταρικές σειρές. Ο TrkA υποδοχέας δεν ανιχνεύεται στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες της μέλαινας ουσίας ούτε των φυσιολογικών, ούτε των "weaver" μυών, ούτε υπάρχει επαγωγή του μετά τη χρόνια χορήγηση των φαρμάκων. Οπότε ο μοριακός μηχανισμός μέσω του οποίου ασκείται η νευροπροστατευτική δράση των DHEA-S και BNN-50 στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες "in vivo" πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω.
Με βάση το γεγονός ότι η χορήγηση του BNN-50 και του συνδυασμού BNN-50 και NAC παρέχει πλήρη νευροπροστασία, ο παρόν συνδυασμός θα μπορούσε μελλοντικά να προταθεί ως προληπτικό νευροπροστατευτικό σχήμα για τη ΝΠ. / Parkinson's disease (PD) is mainly characterized by selective and progressive degeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra (SNPc) of the midbrain. The "weaver" mouse is an ideal model for the study of Parkinson's disease since the degeneration of dopaminergic neurons is progressive, starting at day 7 after the birth, continuing until day 21 where 50% of dopaminergic neurons has already died and reaching 65% at the age of 2 months.
In Parkinson disease, degeneration of the nigrostriatal pathway, leads to an impairement of the operational control of the two neuronal output pathways from the basal ganglia, the "direct" and "indirect". The result is excessive activity of the "indirect" pathway leading to motor dissabilities like (bradykinesia, tremor at rest, rigidity and postural instability). The first objective of this study was to investigate, under dopaminergic denervation in the "weaver" mice, the signal transduction of A2A adenosine receptor (A2ARs), which are colocalized and interact competitively with D2 dopamine receptors on the neurons of the "indirect" pathway. For this reason, we studied after stimulation of A2A receptors, the "in vivo" phosphorylation of DARRR-32 at Th34, a central molecule in the signaling pathway of A2A receptors. Moreover, we studied whether under dopamine denervation, A2A receptors switch on an other transduction pathway. Thus, we examined the involvement of MAP-kinases pathway by detecting the phosphorylation state of ERK1/2 kinases. Our results show elevated basal levels of phosphorylated DARPP-32 at position Thr34 and ERK1/2, probably as an adjustment mechanism on the dopaminergic neurodegeneration. Stimulation of A2A receptors leads to a robust increase of DARPP-32 phosphorylation levels, which would further increase the activity of "indirect" pathway worsening thus the PD symptoms. Stimulation of A2A receptors negatively regulates the increased phosphorylation levels of ERK1/2 kinases, while A2A receptor antagonists have the opposite effect. This effect is likely to have clinical importance since A2A receptor blockade is already used in clinical trials, to ameliorate the symptoms of the disease. However, according to our results, the use of A2A receptors’ antagonists increase the phosphorylation state of ERK1/2 kinases, the activation of which is connected with dyskinesias induced by chronic administration of L-Dopa. For this reason, the regulation of ERK1/2 kinases activity through A2A receptors under dopamine denervation, must be further investigated.
Since there is no curative treatment for PD, the second objective of this study was to investigate the neuroprotective effect basically of "Neurosteroids" and other mild pharmaceutical agents, individually and in combination, on the "weaver" model. The pharmaceutical substrates were applied prior to the degeneration, on the first postnatal day until day 21 of birth when the degeneration reaches 50%. In order to evaluate the neuroprotective effect, we measured by immunohistochemistry, the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra that survived. We also studied the expression of tyrosine hydroxylase (TH) and the expression of the dopamine transporter (DAT) on the terminals of dopaminergic fibers in the striatum. Chronic "in vivo" administration (P1-P21) of the "neurosteroids" DHEA, BNN-50 and the combination BNN-50, and NAC resulted to a significant survival of the dopaminergic cells in the substantia nigra of the "weaver" mice. The administration of BNN-50 and the combination BNN-50/NAC provided also protection to the final dopaminergic axons in the striatum, suggesting that they rescued functional dopaminergic terminals.
Finally, the third objective was to investigate the mechanism by which the "in vivo" neuroprotective action of "neurosteroids" takes place. Therefore we investigated the expression of TrkA receptor on the cells of the substantia nigra of normal and "weaver" mice. The antiapoptotic mechanism does not seem to be mediated through the TrkA receptor as it has been shown "in vitro" experiments using PC12 cells. The TrkA receptor was not detected on the dopaminergic neurons of the substantia nigra nor of the normal or of the "weaver" mice and its expression was not induced after chronic administration of the neurosteroids. Thus, the molecular mechanism through which the dopaminergic neuroprotective effect of DHEA-S and BNN-50 is mediated "in vivo", must be further investigated
Based on the fact that administration of BNN-50 and the combination BNN-50, and NAC provides complete neuroprotection, the present combination could be proposed in future as a neuroprotective agent for PD..
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/6976 |
| Date | 02 April 2014 |
| Creators | Μποτσάκης, Κωνσταντινος |
| Contributors | Ματσώκης, Νικόλαος, Botsakis, Kostantinos, Αγγελάτου, Φεδρωνία, Γιομπρές, Παναγιώτης, Γεωργίου, Χρήστος, Μίντζας, Αναστάσιος, Φλυντζάνης, Κωνσταντίνος, Παναγόπουλος, Νικόλαος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0045 seconds