Η αποικοδόμηση των ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών μέσω του μονοπατιού ουβικιτίνης-πρωτεοσώματος αποτελεί βασική διαδικασία που εξυπηρετεί σημαντικές ομοιοστατικές λειτουργίες του κυττάρου. Η ουβικιτίνη δεσμεύεται ομοιοπολικά στις πρωτεΐνες-στόχους μέσω ενός καταρράκτη ενζυμικών αντιδράσεων, στον οποίο καθοριστικό ρόλο παίζουν τα Ε3 ένζυμα, οι Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης. Η πρωτεΐνη Arkadia είναι μια Ε3 λιγάση με έναν χαρακτηριστικό RING τομέα 69 αμινοξικών καταλοίπων στο C-τελικό άκρο της, μέσω του οποίου ασκεί την δράση της. Εμπλέκεται στο TGF-β σηματοδοτικό μονοπάτι το οποίο ρυθμίζει θετικά, ουβικιτινιλιώνοντας και στοχεύοντας για αποικοδόμηση πρωτεΐνες που αποτελούν αρνητικούς ρυθμιστές του.
Κύριο χαρακτηριστικό του RING τομέα της Arkadia, ο οποίος έχει μελετηθεί και χαρακτηριστεί δομικά μέσω πολυπυρηνικής και πολυδιάστατης NMR φασματοσκοπίας, είναι η δέσμευση δύο ιόντων Zn2+ με χαρακτηριστικό διασταυρώμενο τρόπο (cross brace). Γνωρίζοντας τον πολύ σημαντικό ρόλο του Zn στην δομή και κατ’επέκταση στην δραστικότητα των RING τομέων, πραγματοποιήθηκαν μεταλλάξεις σε δύο αμινοξέα που συμμετέχουν στα μοτίβα δέσμευσης των δύο ιόντων Zn2+, οι H962C και H965C. Το μετάλλαγμα της H962C, στο οποίο εστιάζει η παρούσα εργασία, παρήχθη με βάση τις κλασσικές τεχνικές κλωνοποίησης DNA. Κατάλληλα δείγματα πρωτεΐνης εμπλουτισμένα σε πυρήνες ενεργούς στην φασματοσκοπία NMR, 15N και 13C, προετοιμάστηκαν ώστε να διεξαχθούν τα απαραίτητα πειράματα για τον προσδιορισμό της δομής.
Το σύνολο των NMR φασμάτων απέδειξε ότι πρόκειται για ένα καλά δομημένο και σταθερό πολυπεπτίδιο. Τα δεδομένα από τις μετρήσεις ατομικής απορρόφησης και την επεξεργασία των φασμάτων επιβεβαίωσαν την διατήρηση της δέσμευσης δύο ιόντων Zn2+ ανά πολυπεπτίδιο, όπως στον RING τομέα του φυσικού τύπου της Arkadia. Ταυτόχρονα, πραγματοποιούνται περαιτέρω NMR μελέτες και αναλύσεις των φασμάτων με χρήση των κατάλληλων υπολογιστικών προγραμμάτων για την διερεύνηση της δομής και ικανότητας αλληλεπίδρασης με το Ε2 ένζυμο. / The degradation of the intracellular proteins through the ubiquitin-proteasome pathway is a crucial procedure that serves the cellular homeostasis. Ubiquitin is covalently attached to the target proteins through an enzymatic cascade, in which the E3 enzymes (E3 ubiquitin ligases) play a determinant role. Arkadia is an E3 ubiquitin ligase containing a characteristic RING domain in its C-terminus, comprised of 69 amino acids, which is responsible for its function. It is involved in TFG-β signaling pathway, where it ubiquitinates and subsequently leads negative regulators to proteasomal degradation.
The most important characteristic of Arkadia’s RING domain, which has been studied and structurally characterized through multinuclear and multidimensional NMR spectroscopy, is that it bounds to zinc ions in a cross-brace manner. As the role of the zinc binding is critical for the structure and subsequently the activity of RING domains, His962 and His965, which participate in the zinc binding motifs, were mutated to cysteines. The Arkadia H962C mutant, on which the present work is focused, was produced through the classical techniques of DNA cloning. Protein samples were uniformly labeled in 15N and 13C nuclei in order for all the necessary NMR experiments to be carried out.
The total of the NMR spectra demonstrated that Arkadia RING mutant H962C is a well structured and stable polypeptide. Furthermore, the information that came from the atomic absorption data and the analysis of the NMR spectra confirmed that the RING mutant maintains the RING wild type ability to bind two zinc ions. At the same time, further NMR studies are being carried out in order to investigate its structure and ability to interact with the E2 enzyme.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/7473 |
| Date | 16 May 2014 |
| Creators | Τσαπαρδώνη, Σταματίνα |
| Contributors | Σπυρούλιας, Γεώργιος, Tsapardoni, Stamatina, Περλεπές, Σπύρος, Πατρινός, Γεώργιος, Σπυρούλιας, Γεώργιος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0024 seconds